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Modulation of the renal homeostatic milieu by mononuclear phagocytes in diabetic nephropathy
Modulation of the renal homeostatic milieu by mononuclear phagocytes in diabetic nephropathy
Diabetische Nephropathie (DN) ist der prävalenteste Typus der chronischen Niereninsuffizienzen (CNI) in der westlichen Welt und die Hauptursache für Nierenversagen. Diabetische Nephropathie entsteht als Komplikation von Diabetes mellitus und die Pathogenese ist daher definiert durch systemische Änderung des Blutzuckerspiegels und häufig durch erhöhten Blutdruck. Tubulointerstitielle Fibrose ist dabei für die Zerstörung der Nierenfeinstruktur verantwortlich, über die Mechanismen die diesen Prozess vorantreiben ist allerdings kaum etwas bekannt. DN ist ein steriler Entzündungsprozess, da Immunzellinfiltrate mit voranschreitender Krankheit und Fibrose zunehmen, ohne dass externe Pathogene vorhanden sind. Myeloische Zelltypen treten im Verlauf der DN vermehrt auf und Makrophagen und Dendritische Zellen (DC) werden als treibende Kraft für die fibrotischen Prozesse in CNI diskutiert. Über den vor Kurzem beschriebenen nierenspezifischen myeloischen CD209 und CD14 positiven Phänotyp der Mononukleären Phagozyten (2+MoPh) wurde eine Anreicherung in CNI berichtet. Mittels cDNA-Microarrays und einem bioinformatischen Dekonvolutionsansatz wurde gezeigt, dass 2+MoPh assoziierte Gensignaturen signifikant erhöht in menschlichen DN Biopsien, verglichen mit gesunden Kontrollen, vorliegen. Die Erhöhung korrelierte mit einer Reduktion der Nierenfunktion. Weiterhin wurden Veränderungen in der transkriptionellen Regulation homöostatischer Schlüsselsignalwege in Proben mit erhöhten 2+MoPh Signalen nachgewiesen. Mittels einem eigens für diese Studie generierten Reportervektor- und Klonierungssystem wurden Kokultur-Experimente mit in-vitro polarisierten 2+MoPh und unreifen DC als Kontrollen durchgeführt, um die direkten Auswirkungen auf diese Signalwege zu bestimmen. Als Ergebnis zeigte sich eine starke Aktivierung der Hedgehog, WNT, TGFβ und MAPK Signalwege in parenchymalen Modellzellen bei Kokultur mit 2+MoPh. Die Signale mit denen 2+MoPh Zellen in Kokultur Einfluss nehmen wurden als Protein/Peptid basiert, unabhängig von Zell-Zell Kontakten und als nicht auf Exosomen basierend bestimmt. Eine zentrale Rolle für MAPK Komponenten konnte in Studien mit niedermolekularen Antagonisten belegt werden. Eine Gesamtgenliste bestehend aus den vier in-vitro identifizierten Signalwegen wurde als Basis für eine gewichtete Genkoexpressionsanalyse (WGCNA) verwendet um koregulierte Genmodule zu identifizieren. Dabei wurden gefundene Module auch mit der Gensignatur für 2+MoPh im transkriptionellen DN-Patientendatensatz assoziiert. Weitere Analysen der mit der 2+MoPh Präsenz korrelierenden Einzelgene zeigten eine ausgeprägte MAPK-assoziierte Signatur. Zusammen deuten diese Ergebnisse auf eine starke MAPK basierte Komponente als treibende Kraft für fibrotische Prozesse in DN hin., Diabetic nephropathy (DN) is the most prevalent type of chronic kidney disease (CKD) in the western world, and represents the leading cause of end stage renal disease. DN develops as a complication of diabetes mellitus, and thus the pathogenesis is defined by systemic changes in blood glucose and often increased blood pressure. Tubulointerstitial renal fibrosis is causal to the destruction of the kidney fine structure, but the specific mechanisms driving it are still poorly understood. DN is a sterile inflammatory process, since immune infiltrates increase with disease progression and tissue fibrosis, in the absence of external pathogens. Myeloid cell types are found to be increased in DN, and macrophages and dendritic cells (DC) have been proposed to act as drivers of fibrotic processes in CKD. The recently described kidney specific myeloid CD209 and CD14 positive phenotype of mononuclear phagocytes (2+MoPh) was reported to be enriched in CKD. Using a set of cDNA microarrays and a bioinformatics deconvolution approach, 2+MoPh-associated gene signatures were shown to be significantly increased in human DN biopsy samples, as compared to healthy controls. The increase of 2+MoPh-related genes correlated with a decrease in renal function. Additionally, transcriptomic regulation of key homeostatic pathways was found to be altered in samples with enhanced 2+MoPh signals. To establish direct effects on these pathways, a reporter vector and cloning system specifically generated for this study was used for co-incubation experiments carried out using in-vitro polarized 2+MoPh and immature DC control cells. The results showed strong activation of the Hedgehog, WNT, TGFβ and MAPK pathways in model parenchymal cells by co-incubation with 2+MoPh cells. The nature of the signals exerted by 2+MoPh cells in co-culture was found to be protein/peptide based, not reliant on cell-cell contact, and not exosome mediated. Small molecule antagonist studies identified MAPK components as playing a central role in the activation seen. Using a compiled gene list derived from the four pathways identified in the in-vitro validation study, a weighted gene co-expression analysis (WGCNA) was then used to identify co-regulated gene modules across the four pathways, and associated with an increase in 2+MoPh gene signatures in the DN patient transcriptomic data. Further study of the individual genes correlated with 2+MoPh presence identified a pronounced MAPK-associated signature. Together, these findings suggest a strong MAPK based component as a driving force of fibrosis in DN.
Diabetic nephropathy, MAPK, Homeostasis, Signaling, 2+MoPh
Jäckel, Carsten
2017
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Jäckel, Carsten (2017): Modulation of the renal homeostatic milieu by mononuclear phagocytes in diabetic nephropathy. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Diabetische Nephropathie (DN) ist der prävalenteste Typus der chronischen Niereninsuffizienzen (CNI) in der westlichen Welt und die Hauptursache für Nierenversagen. Diabetische Nephropathie entsteht als Komplikation von Diabetes mellitus und die Pathogenese ist daher definiert durch systemische Änderung des Blutzuckerspiegels und häufig durch erhöhten Blutdruck. Tubulointerstitielle Fibrose ist dabei für die Zerstörung der Nierenfeinstruktur verantwortlich, über die Mechanismen die diesen Prozess vorantreiben ist allerdings kaum etwas bekannt. DN ist ein steriler Entzündungsprozess, da Immunzellinfiltrate mit voranschreitender Krankheit und Fibrose zunehmen, ohne dass externe Pathogene vorhanden sind. Myeloische Zelltypen treten im Verlauf der DN vermehrt auf und Makrophagen und Dendritische Zellen (DC) werden als treibende Kraft für die fibrotischen Prozesse in CNI diskutiert. Über den vor Kurzem beschriebenen nierenspezifischen myeloischen CD209 und CD14 positiven Phänotyp der Mononukleären Phagozyten (2+MoPh) wurde eine Anreicherung in CNI berichtet. Mittels cDNA-Microarrays und einem bioinformatischen Dekonvolutionsansatz wurde gezeigt, dass 2+MoPh assoziierte Gensignaturen signifikant erhöht in menschlichen DN Biopsien, verglichen mit gesunden Kontrollen, vorliegen. Die Erhöhung korrelierte mit einer Reduktion der Nierenfunktion. Weiterhin wurden Veränderungen in der transkriptionellen Regulation homöostatischer Schlüsselsignalwege in Proben mit erhöhten 2+MoPh Signalen nachgewiesen. Mittels einem eigens für diese Studie generierten Reportervektor- und Klonierungssystem wurden Kokultur-Experimente mit in-vitro polarisierten 2+MoPh und unreifen DC als Kontrollen durchgeführt, um die direkten Auswirkungen auf diese Signalwege zu bestimmen. Als Ergebnis zeigte sich eine starke Aktivierung der Hedgehog, WNT, TGFβ und MAPK Signalwege in parenchymalen Modellzellen bei Kokultur mit 2+MoPh. Die Signale mit denen 2+MoPh Zellen in Kokultur Einfluss nehmen wurden als Protein/Peptid basiert, unabhängig von Zell-Zell Kontakten und als nicht auf Exosomen basierend bestimmt. Eine zentrale Rolle für MAPK Komponenten konnte in Studien mit niedermolekularen Antagonisten belegt werden. Eine Gesamtgenliste bestehend aus den vier in-vitro identifizierten Signalwegen wurde als Basis für eine gewichtete Genkoexpressionsanalyse (WGCNA) verwendet um koregulierte Genmodule zu identifizieren. Dabei wurden gefundene Module auch mit der Gensignatur für 2+MoPh im transkriptionellen DN-Patientendatensatz assoziiert. Weitere Analysen der mit der 2+MoPh Präsenz korrelierenden Einzelgene zeigten eine ausgeprägte MAPK-assoziierte Signatur. Zusammen deuten diese Ergebnisse auf eine starke MAPK basierte Komponente als treibende Kraft für fibrotische Prozesse in DN hin.

Abstract

Diabetic nephropathy (DN) is the most prevalent type of chronic kidney disease (CKD) in the western world, and represents the leading cause of end stage renal disease. DN develops as a complication of diabetes mellitus, and thus the pathogenesis is defined by systemic changes in blood glucose and often increased blood pressure. Tubulointerstitial renal fibrosis is causal to the destruction of the kidney fine structure, but the specific mechanisms driving it are still poorly understood. DN is a sterile inflammatory process, since immune infiltrates increase with disease progression and tissue fibrosis, in the absence of external pathogens. Myeloid cell types are found to be increased in DN, and macrophages and dendritic cells (DC) have been proposed to act as drivers of fibrotic processes in CKD. The recently described kidney specific myeloid CD209 and CD14 positive phenotype of mononuclear phagocytes (2+MoPh) was reported to be enriched in CKD. Using a set of cDNA microarrays and a bioinformatics deconvolution approach, 2+MoPh-associated gene signatures were shown to be significantly increased in human DN biopsy samples, as compared to healthy controls. The increase of 2+MoPh-related genes correlated with a decrease in renal function. Additionally, transcriptomic regulation of key homeostatic pathways was found to be altered in samples with enhanced 2+MoPh signals. To establish direct effects on these pathways, a reporter vector and cloning system specifically generated for this study was used for co-incubation experiments carried out using in-vitro polarized 2+MoPh and immature DC control cells. The results showed strong activation of the Hedgehog, WNT, TGFβ and MAPK pathways in model parenchymal cells by co-incubation with 2+MoPh cells. The nature of the signals exerted by 2+MoPh cells in co-culture was found to be protein/peptide based, not reliant on cell-cell contact, and not exosome mediated. Small molecule antagonist studies identified MAPK components as playing a central role in the activation seen. Using a compiled gene list derived from the four pathways identified in the in-vitro validation study, a weighted gene co-expression analysis (WGCNA) was then used to identify co-regulated gene modules across the four pathways, and associated with an increase in 2+MoPh gene signatures in the DN patient transcriptomic data. Further study of the individual genes correlated with 2+MoPh presence identified a pronounced MAPK-associated signature. Together, these findings suggest a strong MAPK based component as a driving force of fibrosis in DN.