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Untersuchungen zum Einfluss der Zytokine CD40L, BAFF, IL10 und IL21 auf Proliferation, Überleben und Phänotypänderungen von B-Zellen des Haushuhns in vitro
Untersuchungen zum Einfluss der Zytokine CD40L, BAFF, IL10 und IL21 auf Proliferation, Überleben und Phänotypänderungen von B-Zellen des Haushuhns in vitro
Ziel dieser Arbeit war es, das aus der Säuger-B-Zellentwicklung bekannte, potente Zytokin IL21 in Kombination mit CD40L, BAFF und IL10 zur Stimulation von Hühner-B-Zellen aus Bursa und Milz einzusetzen und deren Effekte auf Proliferation, Überleben und phänotypische Änderungen in der Expression wichtiger Oberflächenmoleküle zu untersuchen. Die Proliferation betreffend, hatten in beiden Organen weder IL10 noch IL21 alleine einen Effekt. Der Zusatz von BAFF führte zu einer geringfügigen, CD40L zu einer stärkeren Erhöhung der Proliferationsrate. Während IL10 und IL21 einen deutlichen Synergismus mit CD40L und eine extrem hohe 3H-Thymidin-Aufnahme zeigten, bewirkte die Kombination CD40L+BAFF keine weitere Steigerung der Proliferation. Die maximale Proliferation wurde in der Bursa nur durch CD40L+IL21 erzielt. In Milzzellkulturen gelang dies dagegen sowohl durch CD40L+IL21 als auch durch CD40L+IL10. Interessanterweise konnte ein, wenn im Vergleich zu CD40L auch schwächerer, Synergismus zwischen BAFF und IL21 in B-Zellen aus Bursa- und Milz nachgewiesen werden. Da BAFF und CD40L gemeinsame Teilschritte der NFκB-Signalkaskade aktivieren, scheint BAFF hier als abgeschwächter Ersatz für das CD40-Signaling zu dienen. Mit Hilfe des Proliferationsfarbstoffes eFluor670 wurde nachgewiesen, dass in gemischten Lymphozytenpopulationen der Milz durch die verwendeten Zytokine fast ausschließlich B-Zellen zur Proliferation angeregt wurden und sich in Ansätzen mit CD40L+IL10 und CD40L+IL21 annähernd 100 % der B-Zellen geteilt haben. Die Anzahl lebender B-Zellen war in den Stimulationen mit hohen Proliferationsraten am größten. Aber auch BAFF war in der Lage, die Anzahl lebender B-Zellen zu steigern und zeigte dabei einen größeren Effekt auf die immaturen B-Zellen der Bursa. Durch Vergleich des Lebend-Tot-Index mit dem Proliferationsindex fiel auf, dass auf Bursalymphozyten die Zytokin-induzierte Proliferation bei weitem überwog. In Milzlymphozyten war dagegen der Lebend-Tot-Index für alle Stimulationen entweder gleich dem Proliferationsindex bzw. überstieg diesen für die Kombination aus CD40L+BAFF+IL21+IL10 sogar deutlich. Während die Zytokine folglich in den immaturen B-Zellen aus der Bursa massiv Proliferation induzieren, die Zellen aber auch sehr rasch absterben lassen, führen die gleichen Stimuli in den weiter differenzierten, maturen B-Zellen aus der Milz nicht nur zur Proliferation, sondern erhöhen auch ihre Überlebensrate. Zusammenfassung 82 Die durchflusszytometrischen Färbungen zeigten, dass durch die Stimulation mit den ausgewählten Zytokinkombinationen die Expression von B-Zell-Rezeptor, Zytokinrezeptoren (CD40, BAFF-R), Aktivierungsmarkern (CD80, MHCII) und Chemokinrezeptoren (CXCR4, CXCR5) stark verändert wurde, wobei sich auch hier deutliche Unterschiede zwischen kultivierten Bursa- und Milzlymphozyten zeigten. Bei den B-Zellen aus der Bursa führte alleine die Kultivierung in Medium zu einer deutlichen Aktivierung und verstärkten Expression aller untersuchten Oberflächenproteine, besonders deutlich war dies für CXCR4. Dieser Effekt wurde auch durch die Zugabe von BAFF, IL10 oder IL21 kaum beeinflusst. Alle Stimulationen, die CD40L enthielten, führten jedoch zu einer weiteren Erhöhung der Expression von B-Zellrezeptor und MHCII, einem Phänotyp, der in vivo den aus der Bursa emigrierenden Zellen entspricht. Die Kombination CD40L+IL21 verminderte außerdem die Expression von CXCR5, was eine Voraussetzung für die Emigration darstellen könnte. Die Phänotypisierung der stimulierten Milz-B-Zellen ergab dagegen ein deutlich heterogeneres Bild. So führte die Kultivierung in Medium alleine zu keiner erhöhten Expression von CD80 und MHCII, die Expression des B-Zellrezeptors wurde sogar halbiert. Wie in Bursazellen wurde aber auch hier eine extrem starke Induktion von CXCR4 beobachtet. BAFF, IL10 und IL21 alleine wiesen eine z.T. verstärkende, z.T. inhibierende Funktion auf die Expression der Marker auf. Die Kombinationen mit CD40L führten zu einer starken Induktion von CD80 und MHCII. Die Expression von Bu1, einem Hühner spezifischen B-Zellmarker, der im Verlauf der Differenzierung zur Plasmazelle langsam verloren geht, war vor allem in der Kombination aus CD40L+IL21 stark reduziert. Auffällig war in den Milzzellkulturen außerdem, dass durch mehrere Stimulationen für die Aktivierungsmarker, CD40, BAFF-R und den B-Zellrezeptor eine kleine Subpopulation mit sehr niedriger Expression entstand, deren Funktion noch geklärt werden muss. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass es gelungen ist, durch die Stimulation mit synergistisch wirkenden Zytokinen in Bursalymphozyten einen hoch proliferativen, aktivierten Zustand ähnlich der Situation in vivo im Follikelcortex zu induzieren. B-Zellen aus der Milz konnten ebenfalls stark zur Proliferation angeregt werden, wie es in vivo bei Bildung von Germinalen Zentren vorkäme, und zeigten phänotypisch eine weitergehende Differenzierung in Richtung von Plasmablasten mit der Entstehung von zusätzlichen Subpopulationen. So zeigt die vorliegende Arbeit, dass die gleichen Zytokin-Signale in der B-Zelldifferenzierung in Bursa und Milz unterschiedliche zelluläre Reaktionen induzieren., Aim of this study was to use IL21, a cytokine well known for its role in mammalian B-cell development, in combination with CD40L, BAFF and IL10 to stimulate chicken B-cells from the bursa of Fabricius and the spleen and analyse the cytokines’ effects on proliferation, survival and expression of selected surface molecules. Regarding proliferation, on B-lymphocytes from both organs neither IL10 nor IL21 showed an effect on their own. Adding of BAFF to the cultures, lead to a minor increase, the Addition of CD40L to a considerable increase of cell proliferation. While IL10 and IL21 showed a very strong synergism with CD40L and resulted in an extremely high 3H-thymidine uptake (>300.000 cpm), combining CD40L and BAFF did not further enhance cell proliferation. In bursal cell cultures the maximal proliferation rate was solely obtained with CD40L+IL21, in spleenocytes this worked with both combinations CD40L+IL21 and CD40L+IL10. Interestingly, for B-cells from both organs also a synergism between BAFF and IL21 was observed, though weaker than the effect of CD40L+IL21. As BAFF and CD40L share parts of the NFκB signaling cascade, BAFF seems to function as a partial replacement for CD40L in this setting. Experiments with the proliferation dye eFlour670 demonstrated that in mixed leucocyte cultures from the spleen by the selected cytokine combinations proliferation was almost exclusively induced in B-cells and in cultures with CD40L+IL21 and CD40L+IL10 not only a subpopulation but virtually 100% of B-cells proliferated. Stimulations with a high proliferation rate also obtained the highest numbers of viable cells per culture. In addition, BAFF did increase the number of viable cells with a more pronounced effect on immature bursal then more mature splenic B-cells. Comparison of viability-index and proliferation-index revealed that in cultures from bursal B-cells cytokine induced proliferation clearly outweighed the pro-survival effect. In contrast, in cultures of splenic B-cells for most cytokine combinations the viability-index was quite similar to the proliferation-index and exceeded it even clearly for CD40L+IL10+IL21+BAFF. Thus the applied cytokine combinations induce strong proliferation in bursal cells, which is combined with rapid cell death, while the very same stimuli in cultures from further differentiated, mature B-cells from the spleen do induce proliferation and at the same time increase viability. Summary 84 As shown by flow cytometry, stimulation with selected cytokines did strongly affect surface expression of B cell receptor (BCR), cytokine receptors (BAFF-R, CD40), activation markers (CD80, MHCII) and chemokine receptors (CXCR4, CXCR5), again revealing significant differences between cells from bursa and spleen. Culture of the cell in medium only lead in bursal B-cells already to a strong activation and increased the expression of all analyzed surface proteins, which was most pronounced for CXCR4. Addition of BAFF, IL10 or IL21 did hardly induce additional changes. However, all stimulations containing CD40L further increased the expression of BCR and MHCII, a phenotype corresponding to cells, which in vivo emigrate from the bursa. In addition, CD40L+IL21 reduced CXCR5 expression, which could be a prerequisite for emigration. Phenotyping of stimulated splenic B-cells resulted in a more heterogeneous picture. As in bursal cells cultivation in medium alone did strongly induce CXCR4, but did not increase the expression of CD80 and MHCII and BCR expression was even reduced by halve. BAFF; IL10 and IL21 alone showed partly an enhancing and partly an inhibiting effect on marker expression. However, their combination with CD40L consistently induced a strong upregulation of CD80 and MHCII. Interestingly, in spleen cell cultures several cytokine combinations induced a small subpopulation with very low expression of activation markers, CD40, BAFF-R and BCR, whose function has to be resolved. In summary, this work demonstrated that stimulation with synergistically acting cytokines is able to induce a highly proliferative, activated state in bursal lymphocytes, which is similar to the situation in the follicle cortex in vivo. B-lymphocytes from the spleen were as well stimulated to strong proliferation, a state in vivo occurring in germinal centers. In addition, marker expression on those cells showed signs of further differentiation towards a plasmablast like phenotype with the formation of further subpopulations. Hence, in cultures mimicking chicken B-cell differentiation identical cytokine signals induces different cellular reactions in cells from bursa and spleen.
immunology, chicken, cytokines, interleukin 21, Bursa, spleen Immunologie, Huhn, Zytokine, Interleukin 21, Bursa, Milz
Postrak, Larissa
2017
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Postrak, Larissa (2017): Untersuchungen zum Einfluss der Zytokine CD40L, BAFF, IL10 und IL21 auf Proliferation, Überleben und Phänotypänderungen von B-Zellen des Haushuhns in vitro. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

Ziel dieser Arbeit war es, das aus der Säuger-B-Zellentwicklung bekannte, potente Zytokin IL21 in Kombination mit CD40L, BAFF und IL10 zur Stimulation von Hühner-B-Zellen aus Bursa und Milz einzusetzen und deren Effekte auf Proliferation, Überleben und phänotypische Änderungen in der Expression wichtiger Oberflächenmoleküle zu untersuchen. Die Proliferation betreffend, hatten in beiden Organen weder IL10 noch IL21 alleine einen Effekt. Der Zusatz von BAFF führte zu einer geringfügigen, CD40L zu einer stärkeren Erhöhung der Proliferationsrate. Während IL10 und IL21 einen deutlichen Synergismus mit CD40L und eine extrem hohe 3H-Thymidin-Aufnahme zeigten, bewirkte die Kombination CD40L+BAFF keine weitere Steigerung der Proliferation. Die maximale Proliferation wurde in der Bursa nur durch CD40L+IL21 erzielt. In Milzzellkulturen gelang dies dagegen sowohl durch CD40L+IL21 als auch durch CD40L+IL10. Interessanterweise konnte ein, wenn im Vergleich zu CD40L auch schwächerer, Synergismus zwischen BAFF und IL21 in B-Zellen aus Bursa- und Milz nachgewiesen werden. Da BAFF und CD40L gemeinsame Teilschritte der NFκB-Signalkaskade aktivieren, scheint BAFF hier als abgeschwächter Ersatz für das CD40-Signaling zu dienen. Mit Hilfe des Proliferationsfarbstoffes eFluor670 wurde nachgewiesen, dass in gemischten Lymphozytenpopulationen der Milz durch die verwendeten Zytokine fast ausschließlich B-Zellen zur Proliferation angeregt wurden und sich in Ansätzen mit CD40L+IL10 und CD40L+IL21 annähernd 100 % der B-Zellen geteilt haben. Die Anzahl lebender B-Zellen war in den Stimulationen mit hohen Proliferationsraten am größten. Aber auch BAFF war in der Lage, die Anzahl lebender B-Zellen zu steigern und zeigte dabei einen größeren Effekt auf die immaturen B-Zellen der Bursa. Durch Vergleich des Lebend-Tot-Index mit dem Proliferationsindex fiel auf, dass auf Bursalymphozyten die Zytokin-induzierte Proliferation bei weitem überwog. In Milzlymphozyten war dagegen der Lebend-Tot-Index für alle Stimulationen entweder gleich dem Proliferationsindex bzw. überstieg diesen für die Kombination aus CD40L+BAFF+IL21+IL10 sogar deutlich. Während die Zytokine folglich in den immaturen B-Zellen aus der Bursa massiv Proliferation induzieren, die Zellen aber auch sehr rasch absterben lassen, führen die gleichen Stimuli in den weiter differenzierten, maturen B-Zellen aus der Milz nicht nur zur Proliferation, sondern erhöhen auch ihre Überlebensrate. Zusammenfassung 82 Die durchflusszytometrischen Färbungen zeigten, dass durch die Stimulation mit den ausgewählten Zytokinkombinationen die Expression von B-Zell-Rezeptor, Zytokinrezeptoren (CD40, BAFF-R), Aktivierungsmarkern (CD80, MHCII) und Chemokinrezeptoren (CXCR4, CXCR5) stark verändert wurde, wobei sich auch hier deutliche Unterschiede zwischen kultivierten Bursa- und Milzlymphozyten zeigten. Bei den B-Zellen aus der Bursa führte alleine die Kultivierung in Medium zu einer deutlichen Aktivierung und verstärkten Expression aller untersuchten Oberflächenproteine, besonders deutlich war dies für CXCR4. Dieser Effekt wurde auch durch die Zugabe von BAFF, IL10 oder IL21 kaum beeinflusst. Alle Stimulationen, die CD40L enthielten, führten jedoch zu einer weiteren Erhöhung der Expression von B-Zellrezeptor und MHCII, einem Phänotyp, der in vivo den aus der Bursa emigrierenden Zellen entspricht. Die Kombination CD40L+IL21 verminderte außerdem die Expression von CXCR5, was eine Voraussetzung für die Emigration darstellen könnte. Die Phänotypisierung der stimulierten Milz-B-Zellen ergab dagegen ein deutlich heterogeneres Bild. So führte die Kultivierung in Medium alleine zu keiner erhöhten Expression von CD80 und MHCII, die Expression des B-Zellrezeptors wurde sogar halbiert. Wie in Bursazellen wurde aber auch hier eine extrem starke Induktion von CXCR4 beobachtet. BAFF, IL10 und IL21 alleine wiesen eine z.T. verstärkende, z.T. inhibierende Funktion auf die Expression der Marker auf. Die Kombinationen mit CD40L führten zu einer starken Induktion von CD80 und MHCII. Die Expression von Bu1, einem Hühner spezifischen B-Zellmarker, der im Verlauf der Differenzierung zur Plasmazelle langsam verloren geht, war vor allem in der Kombination aus CD40L+IL21 stark reduziert. Auffällig war in den Milzzellkulturen außerdem, dass durch mehrere Stimulationen für die Aktivierungsmarker, CD40, BAFF-R und den B-Zellrezeptor eine kleine Subpopulation mit sehr niedriger Expression entstand, deren Funktion noch geklärt werden muss. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass es gelungen ist, durch die Stimulation mit synergistisch wirkenden Zytokinen in Bursalymphozyten einen hoch proliferativen, aktivierten Zustand ähnlich der Situation in vivo im Follikelcortex zu induzieren. B-Zellen aus der Milz konnten ebenfalls stark zur Proliferation angeregt werden, wie es in vivo bei Bildung von Germinalen Zentren vorkäme, und zeigten phänotypisch eine weitergehende Differenzierung in Richtung von Plasmablasten mit der Entstehung von zusätzlichen Subpopulationen. So zeigt die vorliegende Arbeit, dass die gleichen Zytokin-Signale in der B-Zelldifferenzierung in Bursa und Milz unterschiedliche zelluläre Reaktionen induzieren.

Abstract

Aim of this study was to use IL21, a cytokine well known for its role in mammalian B-cell development, in combination with CD40L, BAFF and IL10 to stimulate chicken B-cells from the bursa of Fabricius and the spleen and analyse the cytokines’ effects on proliferation, survival and expression of selected surface molecules. Regarding proliferation, on B-lymphocytes from both organs neither IL10 nor IL21 showed an effect on their own. Adding of BAFF to the cultures, lead to a minor increase, the Addition of CD40L to a considerable increase of cell proliferation. While IL10 and IL21 showed a very strong synergism with CD40L and resulted in an extremely high 3H-thymidine uptake (>300.000 cpm), combining CD40L and BAFF did not further enhance cell proliferation. In bursal cell cultures the maximal proliferation rate was solely obtained with CD40L+IL21, in spleenocytes this worked with both combinations CD40L+IL21 and CD40L+IL10. Interestingly, for B-cells from both organs also a synergism between BAFF and IL21 was observed, though weaker than the effect of CD40L+IL21. As BAFF and CD40L share parts of the NFκB signaling cascade, BAFF seems to function as a partial replacement for CD40L in this setting. Experiments with the proliferation dye eFlour670 demonstrated that in mixed leucocyte cultures from the spleen by the selected cytokine combinations proliferation was almost exclusively induced in B-cells and in cultures with CD40L+IL21 and CD40L+IL10 not only a subpopulation but virtually 100% of B-cells proliferated. Stimulations with a high proliferation rate also obtained the highest numbers of viable cells per culture. In addition, BAFF did increase the number of viable cells with a more pronounced effect on immature bursal then more mature splenic B-cells. Comparison of viability-index and proliferation-index revealed that in cultures from bursal B-cells cytokine induced proliferation clearly outweighed the pro-survival effect. In contrast, in cultures of splenic B-cells for most cytokine combinations the viability-index was quite similar to the proliferation-index and exceeded it even clearly for CD40L+IL10+IL21+BAFF. Thus the applied cytokine combinations induce strong proliferation in bursal cells, which is combined with rapid cell death, while the very same stimuli in cultures from further differentiated, mature B-cells from the spleen do induce proliferation and at the same time increase viability. Summary 84 As shown by flow cytometry, stimulation with selected cytokines did strongly affect surface expression of B cell receptor (BCR), cytokine receptors (BAFF-R, CD40), activation markers (CD80, MHCII) and chemokine receptors (CXCR4, CXCR5), again revealing significant differences between cells from bursa and spleen. Culture of the cell in medium only lead in bursal B-cells already to a strong activation and increased the expression of all analyzed surface proteins, which was most pronounced for CXCR4. Addition of BAFF, IL10 or IL21 did hardly induce additional changes. However, all stimulations containing CD40L further increased the expression of BCR and MHCII, a phenotype corresponding to cells, which in vivo emigrate from the bursa. In addition, CD40L+IL21 reduced CXCR5 expression, which could be a prerequisite for emigration. Phenotyping of stimulated splenic B-cells resulted in a more heterogeneous picture. As in bursal cells cultivation in medium alone did strongly induce CXCR4, but did not increase the expression of CD80 and MHCII and BCR expression was even reduced by halve. BAFF; IL10 and IL21 alone showed partly an enhancing and partly an inhibiting effect on marker expression. However, their combination with CD40L consistently induced a strong upregulation of CD80 and MHCII. Interestingly, in spleen cell cultures several cytokine combinations induced a small subpopulation with very low expression of activation markers, CD40, BAFF-R and BCR, whose function has to be resolved. In summary, this work demonstrated that stimulation with synergistically acting cytokines is able to induce a highly proliferative, activated state in bursal lymphocytes, which is similar to the situation in the follicle cortex in vivo. B-lymphocytes from the spleen were as well stimulated to strong proliferation, a state in vivo occurring in germinal centers. In addition, marker expression on those cells showed signs of further differentiation towards a plasmablast like phenotype with the formation of further subpopulations. Hence, in cultures mimicking chicken B-cell differentiation identical cytokine signals induces different cellular reactions in cells from bursa and spleen.