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Mesenchymal stem/stromal cells engineered to express the protease inhibitor alpha-1 antitrypsin for the treatment of inflammatory lung diseases
Mesenchymal stem/stromal cells engineered to express the protease inhibitor alpha-1 antitrypsin for the treatment of inflammatory lung diseases
Chronic inflammatory diseases are a growing global health problem. Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) represents a major cause of morbidity and mortality, and is currently the third leading cause of death worldwide. COPD is a devastating progressive lung disease characterized by airflow limitation, chronic bronchitis and bronchiolitis, emphysema, and small airway remodeling. There are no curative options for COPD to date, thus there is a desperate need for novel approaches and treatments. To this end, the goal of this thesis work was to develop and evaluate a novel cell product composed of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) genetically modified to express the protease inhibitor alpha-1 antitrypsin (AAT), thus combining the potent immunomodulatory and cytoprotective properties of MSCs, and of AAT. A major focus was the development of an optimized expression construct/vector system for MSC engineering. Eight versions of gamma-retroviral-based vectors were designed and tested for optimal transgenic expression of human AAT and puromycin-N-acetyltransferase (pac) for antibiotic selection. The constructs differed in the gene promoter used for driving AAT expression, and in the relative position of the expression cassettes within the vector backbone. The vectors were then compared with regards to viral titers, transduction efficacy of primary human MSCs, AAT expression in the supernatant of transduced cells, and cell yield after antibiotic selection. The best results for all parameters were obtained when AAT was expressed from the human eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1 short (EFS) promoter, and the pac gene was linked via an internal ribosome entry site (IRES) sequence. This lead candidate expression cassette was then transferred to a lentiviral backbone to assess if transduction and AAT expression from MSCs could be further increased by using this viral system. While values were higher with the gamma-retroviral vector at low multiplicities of infection (MOIs), transduction reached a plateau and no further increase was possible even when higher MOIs were used. Transduction with the lentiviral construct, however, followed a clear dose-response, reaching transduction efficacies >80% at the highest MOI tested. In vitro functionality of the protease inhibitor AAT expressed from MSCs was confirmed using a neutrophil elastase inhibition assay. A process for large scale transduction and expansion of gene-modified MSCs was subsequently developed. To evaluate the potential therapeutic benefit of AAT-MSCs in vivo, a mouse model of elastase-induced emphysema was used. Treatment of the mice with AAT-MSCs resulted in significant improvement of pulmonary function parameters, while only a slight functional amelioration was observed after treatment with non-modified MSCs. Histopathologic examination of AAT-MSC-treated mice revealed a significant decrease of airspace enlargement, indicating regeneration of pulmonary tissue. Again, the effect was smaller after treatment with non-modified MSCs, demonstrating a more than additive effect of combining AAT and MSCs. In conclusion, the present study provides the first in vivo proof of concept for the treatment of emphysematous COPD using engineered AAT-MSCs., Chronisch entzündliche Erkrankungen sind heutzutage ein globales, im Steigen begriffenes Gesundheitsproblem. Ein wichtiges Beispiel ist die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD), eine verheerende, fortschreitende Erkrankung der Lunge mit hoher Morbidität und Mortalität, gegenwärtig die dritthäufigste Todesursache weltweit. Symptome der COPD sind Atemnot, eine chronische Entzündung der Bronchien und Bronchiolen, die Entwicklung eines Emphysems und ein Umbau der engen Atemwege. Da bislang eine Heilung der COPD nicht möglich ist, besteht ein dringender Bedarf an innovativen Therapieansätzen. Wir entwickelten ein neuartiges Zellprodukt, basierend auf mesenchymalen Stamm-/Stromazellen (MSCs), die genetisch modifiziert wurden, sodass sie den Protease-Inhibitor Alpha-1 Antitrypsin (AAT) exprimieren. Diese Kombination ermöglicht es, die immunmodulatorischen und zytoprotektiven Eigenschaften der MSCs mit jenen von AAT in einem Produkt zu vereinen. Dabei wurde in der vorliegenden Arbeit ein Fokus auf die Entwicklung eines optimierten Expressionskonstruktes gelegt. Es wurden acht gamma-retrovirale Vektoren für die Expression von AAT und Puromycin-N-Acetyltransferase (pac), das eine Antibiotikaselektion genmodifizierter Zellen erlaubt, konzipiert und kloniert. Diese Konstrukte unterscheiden sich sowohl im Promoter, der für die AAT-Expression verwendet wird, als auch in der relativen Anordnung der Expressionskassetten im Plasmid. Die Auswahl des besten Konstrukts wurde anhand eines Vergleichs der Vektoren hinsichtlich der erzielten viralen Titer, der Transduktionseffizienz von primären humanen MSCs, des AAT-Gehalts im Zellkulturüberstand von transduzierten MSCs sowie der Zellausbeute nach Antibiotikaselektion durchgeführt. Die jeweils besten Ergebnisse wurden erzielt, wenn AAT von der kurzen Form des Promoters des humanen eukaryotischen Translationselongationsfaktors 1 alpha 1 (EFS) exprimiert wurde, und das pac Gen durch eine interne ribosomale Eintrittsstelle- (IRES)-Sequenz verknüpft war. Diese favorisierte Expressionskassette wurde in ein lentivirales Plasmid transferiert, um zu untersuchen, ob Transduktion und AAT-Expression in einem solchen System weiter verbessert werden können. Es zeigte sich, dass mittels des gamma-retroviralen Vektors größere Transduktionseffizienzen und AAT-Mengen bei niedriger Multiplizität der Infektion (MOI) erzielt werden konnten, aber bei höheren MOIs keine zusätzliche Verbesserung zu erreichen war. Im Gegensatz dazu folgten Transduktion und AAT-Expression mittels des lentiviralen Vektors einer eindeutigen Dosis-Wirkung, die bei hohen MOIs in Transduktionseffizienzen von >80% resultierte. Ein Neutrophile Elastase Inhibitionstest bestätigte die in vitro Funktionalität von MSC-sezerniertem AAT als Proteaseinhibitor, bevor Transduktions- und Expansionsprozesse zur Herstellung von AAT-MSCs im Großformat etabliert wurden. Um die therapeutische Wirkung von AAT-MSCs in vivo zu untersuchen, wurde ein Mausmodell eines Elastase-induzierten Emphysems durchgeführt. Es zeigte sich, dass die Behandlung von Mäusen mit AAT-MSCs zu einer signifikanten Verbesserung der Lungenfunktion der Tiere führte, während nicht-modifizierte MSCs nur eine geringfügige Wiederherstellung der pulmonalen Funktion bewirkten. Die histopathologische Analyse ergab, dass die Überblähung der Lunge durch die Applikation von AAT-MSCs signifikant vermindert werden konnte, was auf eine Regeneration des Lungengewebes hindeutet. Auch in dieser Auswertung fiel der durch die Behandlung mit nicht-modifizierten MSCs erzielte Effekt geringer aus, was eine additive Wirkung von AAT und MSCs nahelegt. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die vorliegende Arbeit einen ersten Nachweis des Wirkkonzepts von AAT-MSCs für die Behandlung von entzündlichen Lungenerkrankungen wie emphysematöser COPD erbringen konnte.
Not available
Geiger-Schredelseker, Sabine
2017
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Geiger-Schredelseker, Sabine (2017): Mesenchymal stem/stromal cells engineered to express the protease inhibitor alpha-1 antitrypsin for the treatment of inflammatory lung diseases. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Chronic inflammatory diseases are a growing global health problem. Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) represents a major cause of morbidity and mortality, and is currently the third leading cause of death worldwide. COPD is a devastating progressive lung disease characterized by airflow limitation, chronic bronchitis and bronchiolitis, emphysema, and small airway remodeling. There are no curative options for COPD to date, thus there is a desperate need for novel approaches and treatments. To this end, the goal of this thesis work was to develop and evaluate a novel cell product composed of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) genetically modified to express the protease inhibitor alpha-1 antitrypsin (AAT), thus combining the potent immunomodulatory and cytoprotective properties of MSCs, and of AAT. A major focus was the development of an optimized expression construct/vector system for MSC engineering. Eight versions of gamma-retroviral-based vectors were designed and tested for optimal transgenic expression of human AAT and puromycin-N-acetyltransferase (pac) for antibiotic selection. The constructs differed in the gene promoter used for driving AAT expression, and in the relative position of the expression cassettes within the vector backbone. The vectors were then compared with regards to viral titers, transduction efficacy of primary human MSCs, AAT expression in the supernatant of transduced cells, and cell yield after antibiotic selection. The best results for all parameters were obtained when AAT was expressed from the human eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1 short (EFS) promoter, and the pac gene was linked via an internal ribosome entry site (IRES) sequence. This lead candidate expression cassette was then transferred to a lentiviral backbone to assess if transduction and AAT expression from MSCs could be further increased by using this viral system. While values were higher with the gamma-retroviral vector at low multiplicities of infection (MOIs), transduction reached a plateau and no further increase was possible even when higher MOIs were used. Transduction with the lentiviral construct, however, followed a clear dose-response, reaching transduction efficacies >80% at the highest MOI tested. In vitro functionality of the protease inhibitor AAT expressed from MSCs was confirmed using a neutrophil elastase inhibition assay. A process for large scale transduction and expansion of gene-modified MSCs was subsequently developed. To evaluate the potential therapeutic benefit of AAT-MSCs in vivo, a mouse model of elastase-induced emphysema was used. Treatment of the mice with AAT-MSCs resulted in significant improvement of pulmonary function parameters, while only a slight functional amelioration was observed after treatment with non-modified MSCs. Histopathologic examination of AAT-MSC-treated mice revealed a significant decrease of airspace enlargement, indicating regeneration of pulmonary tissue. Again, the effect was smaller after treatment with non-modified MSCs, demonstrating a more than additive effect of combining AAT and MSCs. In conclusion, the present study provides the first in vivo proof of concept for the treatment of emphysematous COPD using engineered AAT-MSCs.

Abstract

Chronisch entzündliche Erkrankungen sind heutzutage ein globales, im Steigen begriffenes Gesundheitsproblem. Ein wichtiges Beispiel ist die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD), eine verheerende, fortschreitende Erkrankung der Lunge mit hoher Morbidität und Mortalität, gegenwärtig die dritthäufigste Todesursache weltweit. Symptome der COPD sind Atemnot, eine chronische Entzündung der Bronchien und Bronchiolen, die Entwicklung eines Emphysems und ein Umbau der engen Atemwege. Da bislang eine Heilung der COPD nicht möglich ist, besteht ein dringender Bedarf an innovativen Therapieansätzen. Wir entwickelten ein neuartiges Zellprodukt, basierend auf mesenchymalen Stamm-/Stromazellen (MSCs), die genetisch modifiziert wurden, sodass sie den Protease-Inhibitor Alpha-1 Antitrypsin (AAT) exprimieren. Diese Kombination ermöglicht es, die immunmodulatorischen und zytoprotektiven Eigenschaften der MSCs mit jenen von AAT in einem Produkt zu vereinen. Dabei wurde in der vorliegenden Arbeit ein Fokus auf die Entwicklung eines optimierten Expressionskonstruktes gelegt. Es wurden acht gamma-retrovirale Vektoren für die Expression von AAT und Puromycin-N-Acetyltransferase (pac), das eine Antibiotikaselektion genmodifizierter Zellen erlaubt, konzipiert und kloniert. Diese Konstrukte unterscheiden sich sowohl im Promoter, der für die AAT-Expression verwendet wird, als auch in der relativen Anordnung der Expressionskassetten im Plasmid. Die Auswahl des besten Konstrukts wurde anhand eines Vergleichs der Vektoren hinsichtlich der erzielten viralen Titer, der Transduktionseffizienz von primären humanen MSCs, des AAT-Gehalts im Zellkulturüberstand von transduzierten MSCs sowie der Zellausbeute nach Antibiotikaselektion durchgeführt. Die jeweils besten Ergebnisse wurden erzielt, wenn AAT von der kurzen Form des Promoters des humanen eukaryotischen Translationselongationsfaktors 1 alpha 1 (EFS) exprimiert wurde, und das pac Gen durch eine interne ribosomale Eintrittsstelle- (IRES)-Sequenz verknüpft war. Diese favorisierte Expressionskassette wurde in ein lentivirales Plasmid transferiert, um zu untersuchen, ob Transduktion und AAT-Expression in einem solchen System weiter verbessert werden können. Es zeigte sich, dass mittels des gamma-retroviralen Vektors größere Transduktionseffizienzen und AAT-Mengen bei niedriger Multiplizität der Infektion (MOI) erzielt werden konnten, aber bei höheren MOIs keine zusätzliche Verbesserung zu erreichen war. Im Gegensatz dazu folgten Transduktion und AAT-Expression mittels des lentiviralen Vektors einer eindeutigen Dosis-Wirkung, die bei hohen MOIs in Transduktionseffizienzen von >80% resultierte. Ein Neutrophile Elastase Inhibitionstest bestätigte die in vitro Funktionalität von MSC-sezerniertem AAT als Proteaseinhibitor, bevor Transduktions- und Expansionsprozesse zur Herstellung von AAT-MSCs im Großformat etabliert wurden. Um die therapeutische Wirkung von AAT-MSCs in vivo zu untersuchen, wurde ein Mausmodell eines Elastase-induzierten Emphysems durchgeführt. Es zeigte sich, dass die Behandlung von Mäusen mit AAT-MSCs zu einer signifikanten Verbesserung der Lungenfunktion der Tiere führte, während nicht-modifizierte MSCs nur eine geringfügige Wiederherstellung der pulmonalen Funktion bewirkten. Die histopathologische Analyse ergab, dass die Überblähung der Lunge durch die Applikation von AAT-MSCs signifikant vermindert werden konnte, was auf eine Regeneration des Lungengewebes hindeutet. Auch in dieser Auswertung fiel der durch die Behandlung mit nicht-modifizierten MSCs erzielte Effekt geringer aus, was eine additive Wirkung von AAT und MSCs nahelegt. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die vorliegende Arbeit einen ersten Nachweis des Wirkkonzepts von AAT-MSCs für die Behandlung von entzündlichen Lungenerkrankungen wie emphysematöser COPD erbringen konnte.