Charakterisierung von Hypoxie-responsiven mesenchymalen Stammzellen unter Verwendung des Natrium-Iodid-Symporters als Reporter- und Therapiegen

Müller, Andrea Maria (2017): Charakterisierung von Hypoxie-responsiven mesenchymalen Stammzellen unter Verwendung des Natrium-Iodid-Symporters als Reporter- und Therapiegen. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Mesenchymale Stammzellen (MSCs) stellen aufgrund ihres Tumortropismus hervorragende Tumorstroma-spezifische Gentransfervehikel zum Transport von Reporter- und Therapiegenen dar. Der Natrium-Iodid-Symporter (NIS) ist ein vielversprechendes theranostisches Gen, welches eine repetitive, nicht-invasive Darstellung der MSC-Biodistribution und der funktionalen Transgenexpression sowie die Applikation therapeutischer Radionuklide (131I, 188Re, 211At) ermöglicht. Eine bedeutende Herausforderung in der Krebstherapie stellen hypoxische Tumorregionen dar, da die Tumorzellen in diesen Arealen äußerst resistent gegenüber konventioneller Chemo- und Radiotherapie sind. Aus diesem Grund ist die Entwicklung innovativer Therapiestrategien, die speziell gegen hypoxische Tumorzellen gerichtet sind, erstrebenswert. In diesem Zusammenhang wurde im ersten Teil dieser Studie, nach der stabilen Transfektion von MSCs mit NIS unter Kontrolle eines synthetischen Hypoxie-induzierbaren Promoters (HIF-NIS-MSCs), das Potenzial einer MSC-vermittelten, Hypoxie-induzierten, NIS-basierten 131I-Therapie evaluiert. Durch die Verwendung von NIS als Reportergen konnte, nach systemischer MSC-Applikation, durch 123I-Szintigraphie und 124I-/18F-TFB-Positronen-Emissions-Tomographie, eine aktive Rekrutierung der HIF-NIS-MSCs in das Tumorstroma sowie eine Hypoxie-induzierte NIS-Expression in einem subkutanen und einem orthotopen hepatozellulären Karzinom- (HCC-) Xenograftmausmodell gezeigt werden. Diese Ergebnisse wurden ex vivo durch eine 123I-Biodistributionsanalyse und Immunhistochemie bestätigt. Durch die Verwendung von NIS als Therapiegen konnte nach Applikation von 131I in HIF-NIS-MSC-behandelten Mäusen eine Verlangsamung des Tumorwachstums und eine Reduktion der Tumorperfusion in orthotopen HCC-Tumoren erzielt werden. Dies führte zu einem signifikant verlängerten Überleben der Therapiegruppe, im Vergleich zu den Kontrolltieren (HIF-NIS-MSC + NaCl und WT-MSC + 131I). Die 131I-Aufnahme in die subkutanen HCC-Tumoren war nicht ausreichend, um einen therapeutischen Effekt zu erzielen. Dies ist vermutlich auf eine geringere MSC-Rekrutierung in das Tumorstroma und einer damit verbundenen geringeren NIS-Expression zurückzuführen. Die tumorale MSC-Rekrutierung ist ein wesentlicher Einflussfaktor auf die MSC-vermittelte, Hypoxie-induzierte, NIS-basierte 131I-Therapie. Daher wurde im nächsten Teil dieser Arbeit das Wachstum des orthotopen Tumors, die Tumorvaskularisierung und die MSC-Verteilung im Tumorstroma durch 3D-Lichtblattfluoreszenzmikroskopie untersucht. Mit dieser deep tissue imaging Methode konnte gezeigt werden, dass sich die MSCs in Clustern im Tumorstroma verteilen und überwiegend in hypoxische Tumorregionen rekrutiert werden. Diese Ergebnisse korrelieren mit 2-dimensionalen immunhistochemischen Analysen, ermöglichen jedoch eine detailliertere Darstellung. Die MSC-vermittelte, Hypoxie-induzierte, NIS-basierte 131I-Therapie ist zudem abhängig vom Level des Hypoxie-induzierbaren Faktor 1 (HIF-1). Auf der Grundlage, dass die Schilddrüsenhormone T3 und T4 über genomische und nicht-genomische Effekte die HIF-1α-Expression induzieren können, wurde im darauffolgenden Teil dieser Studie der Effekt von T3 und T4 auf das Hypoxie-responsive Netzwerk in MSCs in vitro untersucht. Diese Analysen zeigten eine T3- und T4-induzierte Expression von HIF-1α und HIF-1-responsiven Genen in Gegenwart von konditioniertem HCC-Zellmedium. Die erhöhte HIF-1α-Expression führte wiederum im 125I-Uptake Assay zu einer erhöhten NIS-basierten Radioiodaufnahme. Diese Effekte wurden in Integrin αvβ3-negativen HIF-NIS-transfizierten HuH7 Zellen nicht beobachtet und konnten durch den Integrin αvβ3-spezifischen Inhibitor Tetrac und durch Inhibitoren des PI3K und ERK1/2 Signalwegs gehemmt werden. Mit dem Ziel, die Effekte der Schilddrüsenhormone T3 und T4 auf das Hypoxie-responsive Netzwerk in MSCs auch in vivo analysieren zu können, wurde im letzten Teil dieser Arbeit ein Protokoll zur Generierung eines athyreoten Mausmodells etabliert. Dabei wurde die Schilddrüse, nach vorheriger Stimulation der thyreoidalen NIS-Expression durch iodarmes Futter und Thyreotropin (TSH), mittels Radioiod (5,5 MBq 131I) ablatiert. Dieses athyreote Tiermodell erlaubt den Einsatz von NIS als Reportergen, ohne dass die Reporterfunktion des extrathyreoidalen NIS durch die TSH- und damit vom Schilddrüsenhormonstatus-abhängige endogene NIS-Expression in der Schilddrüse beeinträchtigt wird. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen das große Potenzial einer MSC-vermittelten, Hypoxie-induzierten, NIS-basierten 131I-Therapie als eine neue, innovative Therapiestrategie zur Behandlung extrathyreoidaler Tumoren. Diese Therapiestrategie wird durch die Schilddrüsenhormone T3 und T4, welche das Hypoxie-responsive Netzwerk in MSCs über das Integrin αvβ3 aktivieren, moduliert.

Abstract

Due to their tumour tropism, mesenchymal stem cells (MSCs) are excellent tumour stroma-selective delivery vehicles for reporter and therapy genes. The sodium iodide symporter (NIS) is a promising theranostic gene that allows repetitive, non-invasive imaging of MSC biodistribution and functional transgene expression as well as the application of therapeutic radionuclides (131I, 188Re, 211At). A major challenge in cancer therapy are hypoxic tumour regions, since tumour cells in these areas are highly resistant to chemo- and radiotherapy. For this reason, the development of novel, innovative therapy strategies, which specifically target hypoxic tumour cells, is desirable. In this context, the first part of this study comprises the evaluation of the general potential of using a MSC-mediated, hypoxia-induced, NIS-based 131I therapy after stable transfection of MSCs with NIS driven by a synthetic hypoxia-responsive promoter (HIF-NIS-MSCs). Using NIS as reporter gene, active recruitment of the HIF-NIS-MSCs into the tumour microenvironment of a subcutaneous and an orthotopic hepatocellular carcinoma (HCC) xenograft mouse model and hypoxia-induced NIS expression was demonstrated using 123I-scintigraphy and 124I-/18F-TFB-positron emission tomography after systemic MSC application. These results were confirmed by ex vivo 123I-biodistribution and immunohistochemical analyses. Using NIS as therapy gene, application of 131I resulted in delay of tumour growth and reduction of tumour perfusion in HIF-NIS-MSC-treated mice bearing orthotopic HCC tumours. This led to significantly prolonged survival of therapy compared to control mice (HIF-NIS-MSC + NaCl and WT-MSC + 131I). Interestingly, radioiodide uptake into subcutaneous tumours was not sufficient to induce therapeutic effects, presumably due to lower tumoural MSC recruitment and consequently lower NIS expression. Tumoural MSC recruitment strongly influences MSC-mediated, hypoxia-induced, NIS-based 131I therapy. Therefore, in the next part of this work, tumour growth, vascularisation and MSC distribution within the tumour microenvironment were analysed by light-sheet fluorescence microscopy in orthotopic HCC tumours. Using this deep tissue imaging method, MSCs were shown to be spread across the tumour stroma in clusters and predominantly located in hypoxic regions. These results correlate well with 2-dimensional immunohistochemical analyses, while allowing for greater detail. MSC-mediated, hypoxia-induced, NIS-based 131I therapy is further dependent on the level of hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1). On the basis that thyroid hormones T3 and T4 induce HIF-1α expression through genomic and non-genomic mechanisms, the effect of T3 and T4 on the hypoxia response network in MSCs was evaluated in vitro in the next part of this study. These analyses showed a T3- and T4-induced expression of HIF-1α and HIF-1-responsive genes in the presence of HCC cell-conditioned medium. The increased HIF-1α expression in turn led to increased NIS-based radioiodide uptake in an 125I-uptake assay. These effects were not observed in integrin αvβ3-negative, HIF-NIS-transfected HCC cells and were reduced upon treatment with the integrin αvβ3-specific inhibitor tetrac and inhibitors of the PI3K and ERK1/2 pathways. With the objective to analyse the effects of the thyroid hormones T3 and T4 on the hypoxia response network in MSCs in vivo, in the next part of this study a protocol for a thyroid-ablated mouse model was established. In this setting, the thyroid was completely destroyed by stimulating thyroidal NIS expression with a low-iodine diet and thyroid-stimulating hormone (TSH) before applying radioiodide (5.5 MBq 131I). This thyroid-ablated mouse model allows the use of NIS as reporter gene without interference of the extrathyroidal NIS reporter gene with the TSH- and therefore thyroid hormone status-dependent endogenous expression of NIS in the thyroid gland. The results of this work demonstrate the great potential of a MSC-mediated, hypoxia-induced, NIS-based 131I therapy as a novel, innovative therapy strategy for non-thyroidal tumours. This cancer therapy strategy is influenced by thyroid hormones T3 and T4 activating the hypoxia-response network in MSCs via integrin αvβ3.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: Mesenchymale Stammzellen, hepatozelluläres Karzinom, Natrium-Iodid-Symporter, Schilddrüsenhormone, Ablation der Mausschilddrüse
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 3. August 2017
• 1. Bericht­erstatter:in: Nelson, Peter