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Functional characterization of Leishmania donovani myosin-XXI in transfection and lipid binding studies
Functional characterization of Leishmania donovani myosin-XXI in transfection and lipid binding studies
Myosins establish a superfamily of cytoskeleton-associated motor proteins, which are encoded in the genome of virtually all eukaryotic organisms. As molecular motors powered by the hydrolysis of ATP, myosins are capable of translocating along filamentous actin. The transduction of chemical into mechanical energy enables myosins to fulfill a plethora of different functions, as for example muscle contraction, cell-cell adhesion, protein transport, or membrane trafficking. In this context, myosin-XXI plays an extraordinary role. The motor protein, which has recently been described in the literature, is the only myosin the expression of which could thus far be verified in the parasite Leishmania donovani. For the parasite, myosin-XXI is a vital motor protein mediating the important cellular processes of endocytosis, exocytosis, vesicular trafficking, and flagellum formation. In the present work, the molecular bases underlying the function of this essential multifunctional motor protein were aimed to be further elucidated. For this purpose, the full-length myosin as well as individual myosin-XXI domains were characterized using in vivo and in vitro methods. In mammalian cell transfection experiments, functionality and cellular distribution of myosin-XXI were examined in a physiological environment devoid of endogenously expressed myosin-XXI. With the help of gliding filament assays and lipid bilayer binding experiments, directionality of myosin-XXI translocation along F-actin was determined and membrane attachment of the molecular motor was investigated. The transfection studies indicated that myosin-XXI is capable of performing processive movement in mammalian cells, and that the motor protein most probably promotes actin polymerization within the filopodia of transfected cells. These processes depended on the presence of the N-terminal portion of myosin-XXI (aa 1 to 800) comprising an SH3-like domain, the complete motor domain, and part of the adjacent neck and tail region. Gliding filament assays verified for the first time that myosin-XXI, like the vast majority of myosins known to date, is a plus end-directed molecular motor. The analysis of myosin-XXI´s association with membranes demonstrated that the motor protein´s attachment to lipid bilayers requires positive bilayer curvature. In addition, it was shown that myosin-XXI exhibits at least two separate curvature sensitive lipid binding sites. The results obtained in the present study give evidence that the N-terminal domains of myosin-XXI are of great importance for the motor protein´s functionality, though they are known not to be involved in the localization of myosin-XXI within Leishmania donovani. A potential function of the N-terminal parts of myosin-XXI might include the regulation of actin polymerization in membrane protrusions, a process that could possibly play a role in the myosin-XXI-mediated formation of the Leishmania donovani flagellum. From the results of the membrane binding studies, it can be concluded that membrane curvature has a regulatory effect on the spatial distribution of myosin-XXI. Accordingly, myosin-XXI is the first myosin described to bind to membranes depending on membrane geometry. The existence of several separate curvature sensitive lipid binding motifs within the motor protein might in fact guarantee maintenance of the myosin-XXI-membrane association during the conformational changes occurring when myosin-XXI passes through its catalytic cycle., Myosine bilden eine Superfamilie Cytoskelett-assoziierter Motorproteine, die im Genom nahezu aller eukaryotischen Organismen kodiert sind. Angetrieben durch die Hydrolyse von ATP können sich Myosine als molekulare Motoren entlang von filamentösem Aktin fortbewegen. Die Umwandlung chemischer in mechanische Energie ermöglicht es Myosinen, eine Vielzahl verschiedener Funktionen, wie zum Beispiel Muskelkontraktion, Zell-Zell-Adhäsion, Proteintransport oder membran-verlagernden Transport zu erfüllen. Myosin-XXI nimmt hierbei eine besondere Stellung ein. Dieses in der Literatur beschriebene Motorprotein ist das bislang einzige Myosin, dessen Expression in dem Parasiten Leishmania donovani nachgewiesen werden konnte. Für den Parasiten stellt Myosin-XXI ein lebensnotwendiges Motorprotein dar, welches die wichtigen zellulären Prozesse Endozytose, Exozytose, Vesikeltransport und Flagellenbildung vermittelt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die molekularen Grundlagen der Funktion dieses essenziellen multifunktionalen Motorproteins weiter aufzuklären. Hierzu wurden sowohl das vollständige Myosin als auch einzelne seiner Domänen mit Hilfe von in-vivo- und in-vitro-Methoden charakterisiert. In Transfektionsexperimenten an Säugetierzellen wurden die Funktionalität und die zelluläre Verteilung von Myosin-XXI in einer physiologischen Umgebung untersucht, in der kein endogen exprimiertes Myosin-XXI vorhanden war. Mittels Gleitfilamentversuchen und Experimenten zur Bindung an Lipiddoppelschichten wurde die Richtung der Myosinbewegung entlang von F-Aktin bestimmt sowie das Membranbindeverhalten des molekularen Motors genauer erforscht. Die Transfektionsversuche zeigten, dass Myosin-XXI in Säugetierzellen in der Lage ist, sich prozessiv zu bewegen und dass es sehr wahrscheinlich die Aktinpolymerisation in den Filopodien der transfizierten Zellen verstärkt. Für diese Prozesse ist der N-terminale Abschnitt des Myosin-XXI-Moleküls (Aminosäuren 1 bis 800) erforderlich, welcher eine SH3-ähnliche Domäne, die vollständige Motordomäne und einen Teil der anschließenden Hals- und Schwanz-Region umfasst. In Gleitfilamentversuchen wurde erstmalig nachgewiesen, dass sich Myosin-XXI wie die überwiegende Mehrheit der bisher bekannten Myosine in Richtung des Plus-Endes von F-Aktin bewegt. Die Untersuchungen zum Membranbindeverhalten von Myosin-XXI verdeutlichten, dass die Anlagerung des Motorproteins an Lipiddoppelschichten eine positive Oberflächenkrümmung der Doppelschichten voraussetzt. Ferner konnte gezeigt werden, dass das Motorprotein mindestens zwei eigenständige krümmungssensitive Lipidbindungsstellen aufweist. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit belegen, dass die N-terminalen Domänen von Myosin-XXI von hoher Wichtigkeit für die Funktionalität des Motorproteins sind, auch wenn sie bekanntermaßen bei der Lokalisation von Myosin-XXI in Leishmania donovani keine Rolle spielen. Eine mögliche Funktion des N-terminalen Abschnitts von Myosin-XXI könnte die Regulation der Aktinpolymerisation in Membranausstülpungen sein, ein Prozess, der möglicherweise bei der Myosin-XXI-vermittelten Bildung des Leishmania-donovani-Flagellums von Bedeutung ist. Aus den Ergebnissen der Membranbindungsstudien lässt sich schlussfolgern, dass die Oberflächenkrümmung von Membranen regulatorisch auf die räumliche Verteilung von Myosin-XXI wirkt. Hierbei ist Myosin-XXI das erste Myosin, für das eine Abhängigkeit der Membranbindung von der Membrangeometrie beschrieben wird. Das Vorhandensein mehrerer eigenständiger krümmungssensitiver Lipidbindemotive innerhalb des Motorproteins könnte dabei gewährleisten, dass die Membranbindung von Myosin-XXI aufrechterhalten werden kann, während das Motorprotein seinen katalytischen Zyklus und die damit einhergehenden Konformationsänderungen durchläuft.
Myosin, Motor Protein, Lipid Binding, Curvature Sensitivity, Filopodia
Helbig, Constanze
2017
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Helbig, Constanze (2017): Functional characterization of Leishmania donovani myosin-XXI in transfection and lipid binding studies. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Myosins establish a superfamily of cytoskeleton-associated motor proteins, which are encoded in the genome of virtually all eukaryotic organisms. As molecular motors powered by the hydrolysis of ATP, myosins are capable of translocating along filamentous actin. The transduction of chemical into mechanical energy enables myosins to fulfill a plethora of different functions, as for example muscle contraction, cell-cell adhesion, protein transport, or membrane trafficking. In this context, myosin-XXI plays an extraordinary role. The motor protein, which has recently been described in the literature, is the only myosin the expression of which could thus far be verified in the parasite Leishmania donovani. For the parasite, myosin-XXI is a vital motor protein mediating the important cellular processes of endocytosis, exocytosis, vesicular trafficking, and flagellum formation. In the present work, the molecular bases underlying the function of this essential multifunctional motor protein were aimed to be further elucidated. For this purpose, the full-length myosin as well as individual myosin-XXI domains were characterized using in vivo and in vitro methods. In mammalian cell transfection experiments, functionality and cellular distribution of myosin-XXI were examined in a physiological environment devoid of endogenously expressed myosin-XXI. With the help of gliding filament assays and lipid bilayer binding experiments, directionality of myosin-XXI translocation along F-actin was determined and membrane attachment of the molecular motor was investigated. The transfection studies indicated that myosin-XXI is capable of performing processive movement in mammalian cells, and that the motor protein most probably promotes actin polymerization within the filopodia of transfected cells. These processes depended on the presence of the N-terminal portion of myosin-XXI (aa 1 to 800) comprising an SH3-like domain, the complete motor domain, and part of the adjacent neck and tail region. Gliding filament assays verified for the first time that myosin-XXI, like the vast majority of myosins known to date, is a plus end-directed molecular motor. The analysis of myosin-XXI´s association with membranes demonstrated that the motor protein´s attachment to lipid bilayers requires positive bilayer curvature. In addition, it was shown that myosin-XXI exhibits at least two separate curvature sensitive lipid binding sites. The results obtained in the present study give evidence that the N-terminal domains of myosin-XXI are of great importance for the motor protein´s functionality, though they are known not to be involved in the localization of myosin-XXI within Leishmania donovani. A potential function of the N-terminal parts of myosin-XXI might include the regulation of actin polymerization in membrane protrusions, a process that could possibly play a role in the myosin-XXI-mediated formation of the Leishmania donovani flagellum. From the results of the membrane binding studies, it can be concluded that membrane curvature has a regulatory effect on the spatial distribution of myosin-XXI. Accordingly, myosin-XXI is the first myosin described to bind to membranes depending on membrane geometry. The existence of several separate curvature sensitive lipid binding motifs within the motor protein might in fact guarantee maintenance of the myosin-XXI-membrane association during the conformational changes occurring when myosin-XXI passes through its catalytic cycle.

Abstract

Myosine bilden eine Superfamilie Cytoskelett-assoziierter Motorproteine, die im Genom nahezu aller eukaryotischen Organismen kodiert sind. Angetrieben durch die Hydrolyse von ATP können sich Myosine als molekulare Motoren entlang von filamentösem Aktin fortbewegen. Die Umwandlung chemischer in mechanische Energie ermöglicht es Myosinen, eine Vielzahl verschiedener Funktionen, wie zum Beispiel Muskelkontraktion, Zell-Zell-Adhäsion, Proteintransport oder membran-verlagernden Transport zu erfüllen. Myosin-XXI nimmt hierbei eine besondere Stellung ein. Dieses in der Literatur beschriebene Motorprotein ist das bislang einzige Myosin, dessen Expression in dem Parasiten Leishmania donovani nachgewiesen werden konnte. Für den Parasiten stellt Myosin-XXI ein lebensnotwendiges Motorprotein dar, welches die wichtigen zellulären Prozesse Endozytose, Exozytose, Vesikeltransport und Flagellenbildung vermittelt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die molekularen Grundlagen der Funktion dieses essenziellen multifunktionalen Motorproteins weiter aufzuklären. Hierzu wurden sowohl das vollständige Myosin als auch einzelne seiner Domänen mit Hilfe von in-vivo- und in-vitro-Methoden charakterisiert. In Transfektionsexperimenten an Säugetierzellen wurden die Funktionalität und die zelluläre Verteilung von Myosin-XXI in einer physiologischen Umgebung untersucht, in der kein endogen exprimiertes Myosin-XXI vorhanden war. Mittels Gleitfilamentversuchen und Experimenten zur Bindung an Lipiddoppelschichten wurde die Richtung der Myosinbewegung entlang von F-Aktin bestimmt sowie das Membranbindeverhalten des molekularen Motors genauer erforscht. Die Transfektionsversuche zeigten, dass Myosin-XXI in Säugetierzellen in der Lage ist, sich prozessiv zu bewegen und dass es sehr wahrscheinlich die Aktinpolymerisation in den Filopodien der transfizierten Zellen verstärkt. Für diese Prozesse ist der N-terminale Abschnitt des Myosin-XXI-Moleküls (Aminosäuren 1 bis 800) erforderlich, welcher eine SH3-ähnliche Domäne, die vollständige Motordomäne und einen Teil der anschließenden Hals- und Schwanz-Region umfasst. In Gleitfilamentversuchen wurde erstmalig nachgewiesen, dass sich Myosin-XXI wie die überwiegende Mehrheit der bisher bekannten Myosine in Richtung des Plus-Endes von F-Aktin bewegt. Die Untersuchungen zum Membranbindeverhalten von Myosin-XXI verdeutlichten, dass die Anlagerung des Motorproteins an Lipiddoppelschichten eine positive Oberflächenkrümmung der Doppelschichten voraussetzt. Ferner konnte gezeigt werden, dass das Motorprotein mindestens zwei eigenständige krümmungssensitive Lipidbindungsstellen aufweist. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit belegen, dass die N-terminalen Domänen von Myosin-XXI von hoher Wichtigkeit für die Funktionalität des Motorproteins sind, auch wenn sie bekanntermaßen bei der Lokalisation von Myosin-XXI in Leishmania donovani keine Rolle spielen. Eine mögliche Funktion des N-terminalen Abschnitts von Myosin-XXI könnte die Regulation der Aktinpolymerisation in Membranausstülpungen sein, ein Prozess, der möglicherweise bei der Myosin-XXI-vermittelten Bildung des Leishmania-donovani-Flagellums von Bedeutung ist. Aus den Ergebnissen der Membranbindungsstudien lässt sich schlussfolgern, dass die Oberflächenkrümmung von Membranen regulatorisch auf die räumliche Verteilung von Myosin-XXI wirkt. Hierbei ist Myosin-XXI das erste Myosin, für das eine Abhängigkeit der Membranbindung von der Membrangeometrie beschrieben wird. Das Vorhandensein mehrerer eigenständiger krümmungssensitiver Lipidbindemotive innerhalb des Motorproteins könnte dabei gewährleisten, dass die Membranbindung von Myosin-XXI aufrechterhalten werden kann, während das Motorprotein seinen katalytischen Zyklus und die damit einhergehenden Konformationsänderungen durchläuft.