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Etablierung einer neuen Methode zur bioreaktorgestützten Entwicklung von "Tissue Engineered Vascular Grafts"
Etablierung einer neuen Methode zur bioreaktorgestützten Entwicklung von "Tissue Engineered Vascular Grafts"
Hintergrund und Ziel der Arbeit: Der Bedarf an Prothesen zur Verwendung als Bypassmaterial steigt mit zunehmender Alterung unserer Gesellschaft. Die gängigen Bypassprothesen zur Revaskularisierung nach Herzinfarkt sind innere Brustarterien oder Venen des Patienten. Diese haben jedoch verschiedene Limitationen. Die Gefäße können mit der Zeit degenerieren und es können sich beispielsweise Aneurysma oder erneute Verschlüsse bilden, so dass die Suche nach idealen Gefäßprothesen weiterhin relevant ist. Die Entwicklung von Gefäßersatz auf Basis verschiedener Gerüstmaterialien und patienteneigener Zellen ist Ziel dieser vorliegenden Arbeit gewesen. Hierzu wurde ein Bioreaktor-Prototyp, welcher in der eigenen Arbeitsgruppe zuvor im Rahmen einer Diplomarbeit der medizintechnischen Fakultät der TU München von Anja Friedrich entwickelt wurde verwendet. Es erfolgte die Validierung des Reaktors, welcher nach Bedarf umgebaut wurde und die Entwicklung eines Besiedlungs- und Konditionierungsprotokoll. Die generierten Gefäßprothesen wurden molekularbiologisch untersucht. Material und Methoden: Im Rahmen der Bioreaktor-Validierung wurden das Handling und die Dichtigkeit des Reaktors verbessert und die Sterilität durch Sichtkontrolle und mikrobiologische Untersuchungen des Kulturmediums überprüft. Die suffiziente Zahl von 7,5 x 105 Zellen/ cm² (Fibroblasten und Endothelzellen aus der vena saphena magna) zur Besiedlung der Gerüstmaterialien wurde auf Basis eigener empirischer Forschung sowie auf Grundlage von Literaturrecherche ermittelt. Ebenso wurden die Zellen mit sukzessiv steigenden Scherkräften von 10 bis 40 dyn/ cm² konditioniert und eine vollständige Besiedlung der der Scaffoldmaterialien innerhalb von lediglich 6 Tagen ermöglicht. Verschiedene Trägermaterialien (Polyurethan, Collagen, dezellularisierte Venen und bakterielle Cellulose) wurden schließlich mit dem etablierten Protokoll besiedelt und, abgesehen von dezellularisierten Venen, mit denen die Besiedlung nicht möglich war, konditioniert. Anschließend erfolgte die vergleichende Auswertung der besiedelten Scaffolds mittels Rasterelektronenmikroskopie, Immunhistochemie und rt- PCR. Ergebnisse: Die Etablierung eines einfachen Protokolls, das die Herstellung einer Gefäßprothese innerhalb von 3 Wochen nach Entnahme der Spenderzellen ermöglicht, wurde nach Anpassungen am Bioreaktor erfolgreich umgesetzt. Die Verbesserungen umfassten das Hinzufügen zahlreicher Adapter und neuer Schläuche, um die Dichtigkeit des Bioreaktors zu gewährleisten und das Befüllen zu vereinfachen. Außerdem wurde die Rotation des Besiedlungszylinders durch einen zusätzlichen Keilriemen zum Antrieb der hinteren Walze des Mixers gesichert. Die ursprünglich verwendete Pumpe wurde gegen ein Modell ausgetauscht,welches nach der Adhäsion der Zellen eine anschließende Konditionierung erlaubte. Dies war mit der initial verwendeten Pumpe durch eine zu starke Pumpleistung nicht möglich. Mittels rasterelektronischer Mikroskopie konnte nachgewiesen werden, dass die verwendetendezellularisierten Venen nicht für eine Besiedlung mit primären Fibroblasten und Endothelzellen geeignet war. Bei den übrigen Materialien Polyurethan, Collagen und bakterieller Cellulose wurden mit dem etablierten Besiedlungs- und Konditionierungsprogramm jedoch geschlossene Zellrasen und damit gute Besiedlungserfolge nachgewiesen. Die immunhistochemischen Untersuchungen und RNA-Analysen zeigten darüber hinaus, dass bakterielle Cellulose und Polyurethan die vielversprechendsten der getesteten Materialien für die Entwicklung von besiedelten und konditionierten Gefäßprothesen darstellen. Unterschiede in der Aktivierung der Zellen auf den Materialien wurden durch die Expression von ASMA und Fibronektin deutlich. Auf bakterieller Cellulose und Polyurethan fiel diese im Gegensatz zu Zellen auf Collagen vergleichsweise gering aus. Collagen IV hingegen wird besonders stark von Zellen auf bakterieller Cellulose und Polyurethan exprimiert und weist auf die Ausbildung einer Basalmembran hin. Die erhöhte Expression von IL-1α in auf Collagen kultivierten Zelle deutet auf eine verstärkte Synthese von Collagenasen hin und erklärt so die Degradation des Materials im Verlauf der Kultivierung. Schließlich sind insbesondere die bakterielle Cellulose und Polyurethan in der chirurgischen Handhabbarkeit gut geeignet was für den Einsatz beim Patienten essentiell ist. Ausblick: Für eine routinemäßige Verwendung des Bioreaktors zur Generierung von Gefäßprothesen „at the bedside“ für die klinische Anwendung sollte im Folgenden die Besiedlungseinheit des Bioreaktors als Einwegmaterial entwickelt werden. Darüber hinaus sollte die Erforschung der bakteriellen Cellulose weiter vorangetrieben werden, da diese sich als äußerst interessantes nicht degradables Material erwiesen hat.
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Schulte, Julia
2017
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Schulte, Julia (2017): Etablierung einer neuen Methode zur bioreaktorgestützten Entwicklung von "Tissue Engineered Vascular Grafts". Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Hintergrund und Ziel der Arbeit: Der Bedarf an Prothesen zur Verwendung als Bypassmaterial steigt mit zunehmender Alterung unserer Gesellschaft. Die gängigen Bypassprothesen zur Revaskularisierung nach Herzinfarkt sind innere Brustarterien oder Venen des Patienten. Diese haben jedoch verschiedene Limitationen. Die Gefäße können mit der Zeit degenerieren und es können sich beispielsweise Aneurysma oder erneute Verschlüsse bilden, so dass die Suche nach idealen Gefäßprothesen weiterhin relevant ist. Die Entwicklung von Gefäßersatz auf Basis verschiedener Gerüstmaterialien und patienteneigener Zellen ist Ziel dieser vorliegenden Arbeit gewesen. Hierzu wurde ein Bioreaktor-Prototyp, welcher in der eigenen Arbeitsgruppe zuvor im Rahmen einer Diplomarbeit der medizintechnischen Fakultät der TU München von Anja Friedrich entwickelt wurde verwendet. Es erfolgte die Validierung des Reaktors, welcher nach Bedarf umgebaut wurde und die Entwicklung eines Besiedlungs- und Konditionierungsprotokoll. Die generierten Gefäßprothesen wurden molekularbiologisch untersucht. Material und Methoden: Im Rahmen der Bioreaktor-Validierung wurden das Handling und die Dichtigkeit des Reaktors verbessert und die Sterilität durch Sichtkontrolle und mikrobiologische Untersuchungen des Kulturmediums überprüft. Die suffiziente Zahl von 7,5 x 105 Zellen/ cm² (Fibroblasten und Endothelzellen aus der vena saphena magna) zur Besiedlung der Gerüstmaterialien wurde auf Basis eigener empirischer Forschung sowie auf Grundlage von Literaturrecherche ermittelt. Ebenso wurden die Zellen mit sukzessiv steigenden Scherkräften von 10 bis 40 dyn/ cm² konditioniert und eine vollständige Besiedlung der der Scaffoldmaterialien innerhalb von lediglich 6 Tagen ermöglicht. Verschiedene Trägermaterialien (Polyurethan, Collagen, dezellularisierte Venen und bakterielle Cellulose) wurden schließlich mit dem etablierten Protokoll besiedelt und, abgesehen von dezellularisierten Venen, mit denen die Besiedlung nicht möglich war, konditioniert. Anschließend erfolgte die vergleichende Auswertung der besiedelten Scaffolds mittels Rasterelektronenmikroskopie, Immunhistochemie und rt- PCR. Ergebnisse: Die Etablierung eines einfachen Protokolls, das die Herstellung einer Gefäßprothese innerhalb von 3 Wochen nach Entnahme der Spenderzellen ermöglicht, wurde nach Anpassungen am Bioreaktor erfolgreich umgesetzt. Die Verbesserungen umfassten das Hinzufügen zahlreicher Adapter und neuer Schläuche, um die Dichtigkeit des Bioreaktors zu gewährleisten und das Befüllen zu vereinfachen. Außerdem wurde die Rotation des Besiedlungszylinders durch einen zusätzlichen Keilriemen zum Antrieb der hinteren Walze des Mixers gesichert. Die ursprünglich verwendete Pumpe wurde gegen ein Modell ausgetauscht,welches nach der Adhäsion der Zellen eine anschließende Konditionierung erlaubte. Dies war mit der initial verwendeten Pumpe durch eine zu starke Pumpleistung nicht möglich. Mittels rasterelektronischer Mikroskopie konnte nachgewiesen werden, dass die verwendetendezellularisierten Venen nicht für eine Besiedlung mit primären Fibroblasten und Endothelzellen geeignet war. Bei den übrigen Materialien Polyurethan, Collagen und bakterieller Cellulose wurden mit dem etablierten Besiedlungs- und Konditionierungsprogramm jedoch geschlossene Zellrasen und damit gute Besiedlungserfolge nachgewiesen. Die immunhistochemischen Untersuchungen und RNA-Analysen zeigten darüber hinaus, dass bakterielle Cellulose und Polyurethan die vielversprechendsten der getesteten Materialien für die Entwicklung von besiedelten und konditionierten Gefäßprothesen darstellen. Unterschiede in der Aktivierung der Zellen auf den Materialien wurden durch die Expression von ASMA und Fibronektin deutlich. Auf bakterieller Cellulose und Polyurethan fiel diese im Gegensatz zu Zellen auf Collagen vergleichsweise gering aus. Collagen IV hingegen wird besonders stark von Zellen auf bakterieller Cellulose und Polyurethan exprimiert und weist auf die Ausbildung einer Basalmembran hin. Die erhöhte Expression von IL-1α in auf Collagen kultivierten Zelle deutet auf eine verstärkte Synthese von Collagenasen hin und erklärt so die Degradation des Materials im Verlauf der Kultivierung. Schließlich sind insbesondere die bakterielle Cellulose und Polyurethan in der chirurgischen Handhabbarkeit gut geeignet was für den Einsatz beim Patienten essentiell ist. Ausblick: Für eine routinemäßige Verwendung des Bioreaktors zur Generierung von Gefäßprothesen „at the bedside“ für die klinische Anwendung sollte im Folgenden die Besiedlungseinheit des Bioreaktors als Einwegmaterial entwickelt werden. Darüber hinaus sollte die Erforschung der bakteriellen Cellulose weiter vorangetrieben werden, da diese sich als äußerst interessantes nicht degradables Material erwiesen hat.