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Charakterisierung von FLT3 assoziierten Signaltransduktionsproteinen und TET2 als epigenetischer Regulator in der akuten myeloischen Leukämie
Charakterisierung von FLT3 assoziierten Signaltransduktionsproteinen und TET2 als epigenetischer Regulator in der akuten myeloischen Leukämie
Die AML ist eine heterogene Erkrankung, bei der durch die Kombination aus Immunphänotypisierung, Zytogenetik sowie Molekulargenetik eine immer präzisere Diagnosestellung als auch Prognoseeinschätzung gelingt. Zytogenetische als auch molekulargenetische Aberrationen führen zu Fehlregulationen der Zelle, was in konstitutiver Aktivierung von onkogenen Signalwegen resultieren kann. Neue Sequenzierungsmethoden identifizierten innerhalb der letzten Jahre eine Vielzahl von neuen Mutationen in Genen, deren Rolle in der Initiation und Propagation der AML es einzuordnen gilt. In dieser Doktorarbeit erfolgte die funktionelle Charakterisierung der im Jahr 2011 in der AML durch Transkriptom-Sequenzierung detektierten Punktmutationen in SB1. SB1 (=Seta binding protein1) bindet an Seta (=CIN85), das als Multi-Adapter-Protein u.a. über CBL in die Internalisierung von RTKs sowie deren Degradation als auch in die Apoptose involviert ist. Um zu klären, ob die identifizierte SB1-Mutation einen Phänotyp induziert, haben wir diese funktionell charakterisiert. Nach Nachweis einer ubiquitären CIN85-Expression konnte in den mit den unterschiedlichen SB1-Konstrukten transduzierten Ba/F3-Zelllinien eine stabile Expression der Konstrukte nachgewiesen werden, sodass von der Vollständigkeit der Signalkaskade FLT3-CBL-CIN85-SB1 ausgegangen werden konnte. Der FLT3-Rezeptor wurde durch die Koexpression von SB1-WT bzw. SB1-Mutanten weder in der Geschwindigkeit noch Rate signifikant abweichend internalisiert. Die Überexpression von SB1-WT oder Mutanten zeigte weder einen pro-proliferativer Phänotyp noch eine Apoptoseresistenz. In der Immunfärbung wurde SB1-WT vorwiegend um den Nukleolus exprimiert, was sich bei SB1-V89I bzw. -R454Q minimal und bei SB1-R672Q gänzlich zugunsten des Zytoplasmas verschob. Es konnte kein transformierender Phänotyp der neu identifizierten SB1-Mutanten detektiert werden, wofür das Verwenden von Konstrukten unterschiedlicher Spezies trotz hoher Sequenzhomologie einen möglichen Störfaktor der Interaktionskette FLT3-CBL-CIN85-SB1 darstellen oder aber das Zellmodell an sich eine Rolle spielen könnte. Die neu detektierten SB1-Mutationen könnten außerdem lediglich Passenger-Mutationen darstellen. Des Weiteren wurde der transformierende Phänotyp der prognostisch entscheidenden FLT3-ITD-Mutation mit der konstitutiv aktivierenden Mutation der AKT-Kinase AKT1-E17K verglichen. Der FLT3-Rezeptor ist eines der am häufigsten mutierten Gene der AML, die ITD-Mutationen stellen einen attraktiven, allerdings aktuell nur eingeschränkt wirksamen Angriffspunkt zielgerichteter Therapien dar. Auch die konstitutive Aktivierung nachgeschalteter Signalwege wie der PI3K/AKT-Signalweg spielt in der AML eine entscheidende Rolle. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass sowohl AKT1-E17K als auch FLT3-ITD-exprimierende Ba/F3-Zellen ein deutlich erhöhtes IL-3-unabhängiges Wachstum aufwiesen sowie nach IL-3-Entzug vor Apoptose geschützt waren. Eine deutlich stärkere AKT-Phosphorylierung war einzig in allen mit FLT3-ITD- und den unterschiedlichen AKT1-Konstrukten doppelt-transduzierten Zelllinien feststellbar. Die pharmakologische Inhibition verdeutlichte AKT als kritischen Mediator maligner Transformation. Durch AC220 ließen sich die Ba/F3-Zellen, kotransduziert mit FLT3-W51 und der AKT-Mutante, nur auf das Proliferationsniveau der mit AKT1-E17K-transduzierten Zellen hemmen. Der PI3K/AKT-Inhibitor MK2206 hingegen war in der Lage, die Zelllinie FLT3-WT mit Koexpression der AKT1-E17K-Mutante als auch mit der alleinigen Expression von AKT1-E17K vollständig zu inhibieren. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass AKT-Aktivierung zu partieller Apoptoseresistenz gegenüber Tyrosinkinase-Inhibitoren in AML-Patienten führen könnte sowie der PI3K/AKT-Signalweg als einer der am häufigsten aberrant regulierten Signalwege in humanen Tumoren einen interessanten therapeutischen Angriffspunkt darstellt. Im dritten Teil der Doktorarbeit wurden CMML-Patientenproben nach Isolation der CD14-positiven Zellpopulation auf TET2-Mutationen untersucht. Der Nachweis der Konversion von 5-Methylcytosin zu 5-Hydroxy-Methylcytosin in der DNA über Oxidation durch TET2 verdeutlichte dessen entscheidende Rolle als epigenetischer Expressionsregulator. Die in der Literatur beschriebene Mutationsfrequenz von bis zu 50% mit Nachweis der bekannten TET2-Mutationen TET2 R1216X, TET2 Q1139fs, TET2 R1359C, TET2 S1775fs, TET2 I1873T und TET2 K680del konnte bestätigt werden. Die Ba/F3-hTET2-WT-Zellen zeigten keinen pro-proliferativen oder anti-apoptotischen Phänotyp. Weitere Untersuchungen mit der hergestellten RNA, cDNA und Proteinlysaten stehen aktuell noch aus. Individuelle und somit zielgerichtete Therapieansätze rücken zunehmend in den Fokus moderner Medizin. Die Identifikation und genaue Charakterisierung von möglichen Zielmolekülen innerhalb einer Erkrankung bleibt dabei unerlässlich und weiterhin eine große Herausforderung.
akute myeloische Leukämie, FLT3, TET2, AKT1
Hecker, Judith
2017
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Hecker, Judith (2017): Charakterisierung von FLT3 assoziierten Signaltransduktionsproteinen und TET2 als epigenetischer Regulator in der akuten myeloischen Leukämie. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Die AML ist eine heterogene Erkrankung, bei der durch die Kombination aus Immunphänotypisierung, Zytogenetik sowie Molekulargenetik eine immer präzisere Diagnosestellung als auch Prognoseeinschätzung gelingt. Zytogenetische als auch molekulargenetische Aberrationen führen zu Fehlregulationen der Zelle, was in konstitutiver Aktivierung von onkogenen Signalwegen resultieren kann. Neue Sequenzierungsmethoden identifizierten innerhalb der letzten Jahre eine Vielzahl von neuen Mutationen in Genen, deren Rolle in der Initiation und Propagation der AML es einzuordnen gilt. In dieser Doktorarbeit erfolgte die funktionelle Charakterisierung der im Jahr 2011 in der AML durch Transkriptom-Sequenzierung detektierten Punktmutationen in SB1. SB1 (=Seta binding protein1) bindet an Seta (=CIN85), das als Multi-Adapter-Protein u.a. über CBL in die Internalisierung von RTKs sowie deren Degradation als auch in die Apoptose involviert ist. Um zu klären, ob die identifizierte SB1-Mutation einen Phänotyp induziert, haben wir diese funktionell charakterisiert. Nach Nachweis einer ubiquitären CIN85-Expression konnte in den mit den unterschiedlichen SB1-Konstrukten transduzierten Ba/F3-Zelllinien eine stabile Expression der Konstrukte nachgewiesen werden, sodass von der Vollständigkeit der Signalkaskade FLT3-CBL-CIN85-SB1 ausgegangen werden konnte. Der FLT3-Rezeptor wurde durch die Koexpression von SB1-WT bzw. SB1-Mutanten weder in der Geschwindigkeit noch Rate signifikant abweichend internalisiert. Die Überexpression von SB1-WT oder Mutanten zeigte weder einen pro-proliferativer Phänotyp noch eine Apoptoseresistenz. In der Immunfärbung wurde SB1-WT vorwiegend um den Nukleolus exprimiert, was sich bei SB1-V89I bzw. -R454Q minimal und bei SB1-R672Q gänzlich zugunsten des Zytoplasmas verschob. Es konnte kein transformierender Phänotyp der neu identifizierten SB1-Mutanten detektiert werden, wofür das Verwenden von Konstrukten unterschiedlicher Spezies trotz hoher Sequenzhomologie einen möglichen Störfaktor der Interaktionskette FLT3-CBL-CIN85-SB1 darstellen oder aber das Zellmodell an sich eine Rolle spielen könnte. Die neu detektierten SB1-Mutationen könnten außerdem lediglich Passenger-Mutationen darstellen. Des Weiteren wurde der transformierende Phänotyp der prognostisch entscheidenden FLT3-ITD-Mutation mit der konstitutiv aktivierenden Mutation der AKT-Kinase AKT1-E17K verglichen. Der FLT3-Rezeptor ist eines der am häufigsten mutierten Gene der AML, die ITD-Mutationen stellen einen attraktiven, allerdings aktuell nur eingeschränkt wirksamen Angriffspunkt zielgerichteter Therapien dar. Auch die konstitutive Aktivierung nachgeschalteter Signalwege wie der PI3K/AKT-Signalweg spielt in der AML eine entscheidende Rolle. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass sowohl AKT1-E17K als auch FLT3-ITD-exprimierende Ba/F3-Zellen ein deutlich erhöhtes IL-3-unabhängiges Wachstum aufwiesen sowie nach IL-3-Entzug vor Apoptose geschützt waren. Eine deutlich stärkere AKT-Phosphorylierung war einzig in allen mit FLT3-ITD- und den unterschiedlichen AKT1-Konstrukten doppelt-transduzierten Zelllinien feststellbar. Die pharmakologische Inhibition verdeutlichte AKT als kritischen Mediator maligner Transformation. Durch AC220 ließen sich die Ba/F3-Zellen, kotransduziert mit FLT3-W51 und der AKT-Mutante, nur auf das Proliferationsniveau der mit AKT1-E17K-transduzierten Zellen hemmen. Der PI3K/AKT-Inhibitor MK2206 hingegen war in der Lage, die Zelllinie FLT3-WT mit Koexpression der AKT1-E17K-Mutante als auch mit der alleinigen Expression von AKT1-E17K vollständig zu inhibieren. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass AKT-Aktivierung zu partieller Apoptoseresistenz gegenüber Tyrosinkinase-Inhibitoren in AML-Patienten führen könnte sowie der PI3K/AKT-Signalweg als einer der am häufigsten aberrant regulierten Signalwege in humanen Tumoren einen interessanten therapeutischen Angriffspunkt darstellt. Im dritten Teil der Doktorarbeit wurden CMML-Patientenproben nach Isolation der CD14-positiven Zellpopulation auf TET2-Mutationen untersucht. Der Nachweis der Konversion von 5-Methylcytosin zu 5-Hydroxy-Methylcytosin in der DNA über Oxidation durch TET2 verdeutlichte dessen entscheidende Rolle als epigenetischer Expressionsregulator. Die in der Literatur beschriebene Mutationsfrequenz von bis zu 50% mit Nachweis der bekannten TET2-Mutationen TET2 R1216X, TET2 Q1139fs, TET2 R1359C, TET2 S1775fs, TET2 I1873T und TET2 K680del konnte bestätigt werden. Die Ba/F3-hTET2-WT-Zellen zeigten keinen pro-proliferativen oder anti-apoptotischen Phänotyp. Weitere Untersuchungen mit der hergestellten RNA, cDNA und Proteinlysaten stehen aktuell noch aus. Individuelle und somit zielgerichtete Therapieansätze rücken zunehmend in den Fokus moderner Medizin. Die Identifikation und genaue Charakterisierung von möglichen Zielmolekülen innerhalb einer Erkrankung bleibt dabei unerlässlich und weiterhin eine große Herausforderung.