In vivo pharmacological profiling in Xenopus embryos defines a subset of A1 adenosine receptor-selective antagonists with potent anti-angiogenic activities

Gull, Mazhar (2017): In vivo pharmacological profiling in Xenopus embryos defines a subset of A1 adenosine receptor-selective antagonists with potent anti-angiogenic activities. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

The purine nucleoside adenosine is an important intermediate metabolite, which is released from most cells. It mediates signaling through activation of four distinct adenosine receptors (ARs): A1, A2A, A2B, and A3. ARs have been recognized as therapeutic targets for a wide range of physiological processes and pathophysiological conditions, including epilepsy, chronic pain, ischemia, inflammation, and cancer. This has led to the development of various subtype-specific AR antagonists. By screening a chemical library in vivo, we had previously recovered AR antagonists as inhibitors of blood and lymph vessel angiogenesis in Xenopus embryos [Kalin et al. 2009 Blood 114, 1110-1122]. Here, we assessed the role of adenosine signaling in vascular development in Xenopus embryos by testing a panel of subclass-selective AR antagonists for anti-(lymph) angiogenic activities. Compound-treated embryos were assessed phenotypically for evidence of edema formation, which is a reliable pathophysiological indicator of anti-angiogenic activity. Quantitative pharmacological parameters, such as EC50, ECmax, and LC50 values, were established for each compound. While antagonists selective for A2A, A2B, or A3 ARs were typically inactive, all A1 AR antagonists were found to induce edema with EC50 values ranging from 0.3 to 6.7 µM. However, only two compounds, 7-chloro-4-hydroxy-2-phenyl-1, 8-naphthyridine (7CN) and 1,3 Diethyl-8-phenylxanthine (DEPX), had potent anti-angiogenic activities in vivo. Subsequently, structure-activity relationship studies led to the identification of two additional compounds, 7-methyl-2-phenyl-1, 8-naphthyridine (7MN) and 1,3-dipropyl-8-phenylxanthine (DPPX), equally capable of disrupting vascular development in Xenopus embryos. Treatment of primary human endothelial cell cultures demonstrated that only 7CN and 7MN but not DEPX and DPPX disrupted cell proliferation and VEGF-induced sprouting in vitro. Gene expression and knockdown studies in Xenopus embryos failed however to provide evidence for a central role of A1 ARs in vascular development. This suggests that the antiangiogenic activities of 7CN and 7MN may be due to polypharmacology involving inhibition of other targets than A1 ARs alone. In fact, we found that 7CN and 7MN induced destabilization of microtubules, mitotic arrest, and excess DNA replication in endothelial cell cultures. Taken together, phenotypic compound profiling in Xenopus embryos has led to the identification of 7CN and 7MN as promising drug candidates that act as potent anti-angiogenic compounds interfering with essential endothelial cell functions.

Abstract

Das Purinnukleosid Adenosin ist ein wichtiger Metabolit, der von vielen Zellen freigesetzt wird. Adenosin wirkt als Signalmolekül mittels Aktivierung von vier verschiedenen Adenosinrezeptoren (AR): A1, A2A, A2B und A3. AR dienen als vielversprechende Angriffspunkte für die Entwicklung von Arzneimitteln zur Modulation einer breiten Palette von physiologischen Prozessen und pathophysiologischen Zuständen, einschliesslich Epilepsie, chronischen Schmerzen, Ischämie, Entzündungen und Krebs. In der Folge wurden verschiedene subtypspezifische AR-Antagonisten entwickelt. Mittels eines In Vivo Screening-Verfahrens hatte unsere Arbeitsgruppe zuvor mehrere AR-Antagonisten einer chemischen Bibliothek als Inhibitoren der Blut- und Lymphgefässangiogenese in Xenopus Embryonen identifziert [Kalin et al. 2009 Blood 114, 1110-1122]. In der vorliegenden Arbeit untersuchten wir mittels einer Reihe von subklassenselektiven AR-Antagonisten die Rolle der Signalwirkung von Adenosin bei der Bildung des Gefässsystems in Xenopus Embryonen. Insbesondere wurde nach anti-lymphatischen bzw. -angiogenetischen Aktivitäten in vivo gesucht. Wirkstoff-behandelte Embryonen wurden phänotypisch beurteilt und auf Ödembildung als zuverlässigen pathophysiologischen Indikator für anti-angiogenetische Aktivitäten untersucht. Für jede Verbindung wurden quantitative pharmakologische Parameter, wie EC50, ECmax und LC50, ermittelt. Typischerweise waren A2A-, A2B- oder A3-AR-selektive Antagonisten inaktiv. Hingegen waren alle A1 AR-Antagonisten aktiv und induzierten Ödeme mit EC50-Werten von 0.3 bis 6.7 µM. Allerdings besassen nur zwei Verbindungen, 7-Chloro-4-hydroxy-2-phenyl-1, 8-naphthyridin (7CN) und 1,3 Diethyl-8-phenylxanthin (DEPX), starke anti-angiogenetische Aktivitäten in vivo. Anschliessend wurden Studien zur Struktur-Wirkungs-Beziehung durchgeführt. Diese führten zur Identifizierung von zwei zusätzlichen Verbindungen, 7-Methyl-2-phenyl-1, 8-naphthyridin (7MN) und 1,3-Dipropyl-8-phenylxanthin (DPPX), die in der Lage waren, die Gefässbildung in Xenopus Embryonen zu stören. Die Behandlung von primären humanen Endothelzellkulturen zeigte dann, dass nur 7CN und 7MN, aber nicht DEPX und DPPX, in der Lage waren die Proliferation und das VEGF-induzierte Sprouting in vitro zu unterbinden. Umfangreiche Genexpressions- und Knockdown-Studien lieferten keine Hinweise für eine zentrale Rolle von A1 AR bei der vaskulären Gefässbildung in Xenopus Embryonen. Dies weist darauf hin, dass die anti-angiogenetischen Aktivitäten von 7CN und 7MN vermutlich auf Polypharmakologie zurückzuführen sind und sich nicht durch die alleinige Hemmung von A1 ARs erklären lassen. In der Tat fanden wir, dass die Behandlung von endothelialen Zellkulturen mit 7CN und 7MN zu einer Destabilisierung des mikrotubulären Zytoskeletts, einer Blockierung der Mitose und zu übermässiger DNA Replikation führten. Zusammengenommen hat die phänotypische Charakterisierung von AR Antagonisten in Xenopus Embryonen zur Identifizierung von 7CN und 7MN als viel versprechende Wirkstoffkandidaten geführt. Beide Verbindugen haben potente anti-angiogenetische Aktivitäten, welche wesentliche endotheliale Zellfunktionen stören.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: G protein-coupled receptors, adenosine receptor, angiogenesis, lymphangiogenesis, adenosine receptor antagonists, in vivo screening, drug screening
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 7. Juli 2017
• 1. Bericht­erstatter:in: Brändli, André