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Neue Ansätze für die Diagnostik und die Therapie invasiver Schimmelpilzmykosen
Neue Ansätze für die Diagnostik und die Therapie invasiver Schimmelpilzmykosen
Die Inzidenz invasiver Mykosen nimmt weltweit zu und schon jetzt sterben genauso viele Menschen an den zehn häufigsten invasiven Pilzkrankheiten wie an Tuberkulose oder auch Malaria. Besonders gefährdet für eine invasive Mykose sind Patienten nach Organ- und Stammzelltransplantationen sowie Patienten, die unter dem Einfluss Chemotherapeutika oder Immunsuppressiva stehen, aber auch AIDS-Patienten haben ein erhöhtes Risiko zu erkranken. Als häufigster Erreger invasiver Schimmelpilzmykosen gilt immer noch Aspergillus, insbesondere A. fumigatus. Die Nicht-Aspergillus-Schimmelpilze, wie Fusarium spp., Scedosporium spp., Penicillium spp. und verschiedene Zygomyceten, sind aber von zunehmender Bedeutung. Die für invasive Mykosen typischen hohen Mortalitätsraten kommen durch Probleme sowohl in der Diagnostik als auch in der Therapie zustande. Zum einen fehlen sichere und schnelle Nachweisverfahren insbesondere für die Differenzierung von Schimmelpilzen. Zum anderen gibt es nur wenige Antimykotika, gegenüber denen die verschiedenen Pilze noch dazu sehr unterschiedliche Sensitivitäten aufweisen. Der Bedarf für bessere Diagnostika zur genauen Differenzierung sowie neuen therapeutischen Strategien ist deshalb sehr hoch. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden Antikörper gegen Nicht-Aspergillus Schimmelpilze hergestellt, um neue diagnostische Nachweismethoden zu entwickeln. Ein Ziel war es, eine Methode zu entwickeln, um zwischen einer Aspergillus- und einer Fusarium-Infektion differenzieren zu können. Dies ist bisher schwierig, da sich die beiden Pilze u.a. aufgrund ihrer ähnlichen Morphologie in histopathologischen Schnitten oft nicht eindeutig voneinander abgrenzen lassen. Zudem ist auch die Aussagekraft einer positiven Kultur oft fraglich und es kann zu Kreuzreaktionen im Galaktomannan-Assay kommen, der ursprünglich als Aspergillus-spezifisch galt. In dieser Arbeit konnte der AB135-8-Antikörper generiert werden, bei dem es sich um einen monoklonalen IgM-Antikörper handelt, der ein Fusarium-Glykoantigen erkennt, das sowohl auf der Oberfläche des Pilzes vorhanden ist als auch in dessen Kulturüberstand nachgewiesen werden kann. Da dieser Antikörper in vitro auch eine schwache Reaktion mit Aspergillus zeigte, konnten wir mithilfe einer A. fumigatus-Mutante, die keine Galaktofuranose bilden kann, zeigen, dass es sich bei dem AB135-8-Antigen um ein Galaktofuranose-haltiges-Antigen handelt. Durch Kombination dieses Antikörpers und eines Aspergillus-spezifischen Antikörpers konnten wir eine Methode zur histopathologischen Unterscheidung von Aspergillus- und Fusarium-Infektionen etablieren. Des Weiteren konnten wir zeigen, dass das AB135-8-Antigen auch im Kulturüberstand vorhanden ist, was die Möglichkeit bietet, einen Sandwich-ELISA für den serologischen Nachweis zu entwickeln, wodurch eine frühzeitige Diagnostik ermöglicht würde. Um neue antifungale Therapiestrategien zu finden, wurde im zweiten Teil dieser Arbeit untersucht, ob Substanzen, die den Pilz-spezifischen High-Osmolarity-Glycerol- (HOG) Signalweg aktivieren, einen geeigneten Ansatz bieten. Der HOG-Signalweg dient der Stresswahrnehmung des Pilzes und hilft u.a. bei der Aufrechterhaltung des osmotischen Gleichgewichts. Fludioxonil und Iprodione aktivieren diesen Signalweg und zeigten in unseren Tests eine klare antifungale Wirkung nicht nur auf Aspergillus, sondern auch auf Lichtheimia, Rhizopus und Scedosporium. Diese spielen als emerging pathogens eine immer größere Rolle bei invasiven Mykosen und sind aufgrund von Resistenzen gegenüber vielen Antimykotika noch schwerer zu behandeln als Aspergillus. Die genaue Wirkung von Fludioxonil und Iprodione haben wir beispielhaft für A. fumigatus untersucht und herausgefunden, dass diese Substanzen zunächst zu einem sofortigen Wachstumsstop führen und dass bei andauernder Exposition der größte Teil der Hyphen auch abgetötet wird. Es kommt bei Fludioxonilzugabe zum Anschwellen der Hyphen, woraufhin der Pilz mit Septenbildung und Verschluss der septalen Poren reagiert. Außerdem werden die Kontrollmechanismen der Mitose durch Fludioxonil ausgeschaltet und es kommt zur Akkumulation von Zellkernen. Auf den durch diese verschiedenen Prozesse ausgelösten Stress reagiert der Pilz u.a. mit einer Umstrukturierung der Zellwand, die mit einer massiven Galaktomannan-Freisetzung einhergeht. Diese induzierte Freisetzung des Galaktomannan-Antigens könnte die Diagnostik im frühen Infektionsstadium deutlich verbessern. HOG-aktivierende Substanzen zeigten sich durch ihre vielfältige zellbiologische Wirkungsweise und ein Zielprotein, das in Säugetieren nicht existiert, als vielversprechende Kandidaten für die Entwicklung neuer Antimykotika zur Bekämpfung von Schimmelpilzinfektionen., The incidence of invasive fungal diseases is increasing worldwide and there are already as many people dying of the top ten of invasive mycoses as of tuberculosis and malaria. Patients undergoing solid-organ or stem cell transplantation, patients under the influence of chemo- or immunosuppressive therapy and patients with AIDS are at high risk of developing invasive fungal diseases. Aspergillus, especially A. fumigatus, is still the most common mold causing invasive fungal infections, but infections caused by non-Aspergillus-molds such as Fusarium spp., Scedosporium spp., Penicillium spp. and different Zygomycetes are on the rise. The characteristically high mortality rates of invasive mycoses are due to shortcomings in the fields of diagnostics and therapy. On the one hand safe and fast methods for the detection and especially for the differentiation of molds are missing. On the other hand not many antifungal agents exist on the market and they also show variable efficacies against the different fungi. Thus, the need for improved diagnostics for differentiation of fungal pathogens as well as new antifungal strategies to combat fungal infections is high. In the first part of this work antibodies against non-Aspergillus-molds were generated to develop new diagnostic methods. We were in particular interested to find a method for the differentiation between an Aspergillus and a Fusarium infection. This still remains a problem, because both fungi have a similar histological morphology, which makes it nearly impossible to discriminate between the two in histology. Moreover the value of a posititve culture is controversial and cross-reactions in the originally Aspergillus specific thought of galactomannan assay have been reported. In this work we generated the AB135-8 antibody, a monoclonal antibody that recognizes a Fusarium glycoantigen present on the hyphal surface but also released in the culture supernatant. This antibody showed also a weak reactivity with A. fumigatus in-vitro, but no reactivity with an A. fumigatus mutant lacking galactofuranose. This strongly suggests, that galactofuranose is an important component of the AB135-8 antigen. By using a combination of this antibody and another Aspergillus specific antibody, we established a method to differentiate between Aspergillus and Fusarium in histopathological samples. Moreover we could show that the AB135-8 antigen is present in culture supernatants, and thus could be a promising target for a Fusarium-specific serological assay, which would enable an earlier detection of Fusarium infections. The second part of this work concentrated on the development of a new antifungal strategy, particularly on the question whether substances activating the fungal specific high osmolarity glycerol (HOG) pathway are a means to combat invasive mycoses. In fungi, the HOG pathway plays an important role for stress sensing and helps amongst others maintaining the osmotic balance. Fludioxonil and Iprodione are activating this pathway and showed in our tests antifungal effects not just on Aspergillus, but also on Lichtheimia, Rhizopus and Scedosporium. These fungi are emerging pathogens causing invasive fungal diseases of increasing importance and are due to their variable resistance to most antifungal agents even more challenging to treat. We have examined the impact of Fludioxonil and Iprodione on A. fumigatus as a model organism and found out that they are first of all inducing an immediate growth arrest, which was followed by a quantitative killing of hyphae. After addition of Fludioxonil, hyphae started to swell and the fungi reacted with an enhanced septum formation and closure of septal pores. Furthermore the control mechanisms of mitosis were disabled by Fludioxonil and nuclei accumulated in the cells. The fungi reacted to the enhanced stress by restructuring their cell wall, which provokes a massive release of galactomannan. This induced galactomannan release could improve the diagnostics at an early stage of infection. HOG activating agents showed a high negative impact on the cell biology and act on a target protein that does not exist in mammals. Thus they are promising candidates for the development of new antifungals to combat mold infections.
Invasive Schimmelpilzmykose, Aspergillus, Fusarium, HOG-Pathway, Fludioxonil
Wiedemann, Annegret
2017
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Wiedemann, Annegret (2017): Neue Ansätze für die Diagnostik und die Therapie invasiver Schimmelpilzmykosen. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

Die Inzidenz invasiver Mykosen nimmt weltweit zu und schon jetzt sterben genauso viele Menschen an den zehn häufigsten invasiven Pilzkrankheiten wie an Tuberkulose oder auch Malaria. Besonders gefährdet für eine invasive Mykose sind Patienten nach Organ- und Stammzelltransplantationen sowie Patienten, die unter dem Einfluss Chemotherapeutika oder Immunsuppressiva stehen, aber auch AIDS-Patienten haben ein erhöhtes Risiko zu erkranken. Als häufigster Erreger invasiver Schimmelpilzmykosen gilt immer noch Aspergillus, insbesondere A. fumigatus. Die Nicht-Aspergillus-Schimmelpilze, wie Fusarium spp., Scedosporium spp., Penicillium spp. und verschiedene Zygomyceten, sind aber von zunehmender Bedeutung. Die für invasive Mykosen typischen hohen Mortalitätsraten kommen durch Probleme sowohl in der Diagnostik als auch in der Therapie zustande. Zum einen fehlen sichere und schnelle Nachweisverfahren insbesondere für die Differenzierung von Schimmelpilzen. Zum anderen gibt es nur wenige Antimykotika, gegenüber denen die verschiedenen Pilze noch dazu sehr unterschiedliche Sensitivitäten aufweisen. Der Bedarf für bessere Diagnostika zur genauen Differenzierung sowie neuen therapeutischen Strategien ist deshalb sehr hoch. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden Antikörper gegen Nicht-Aspergillus Schimmelpilze hergestellt, um neue diagnostische Nachweismethoden zu entwickeln. Ein Ziel war es, eine Methode zu entwickeln, um zwischen einer Aspergillus- und einer Fusarium-Infektion differenzieren zu können. Dies ist bisher schwierig, da sich die beiden Pilze u.a. aufgrund ihrer ähnlichen Morphologie in histopathologischen Schnitten oft nicht eindeutig voneinander abgrenzen lassen. Zudem ist auch die Aussagekraft einer positiven Kultur oft fraglich und es kann zu Kreuzreaktionen im Galaktomannan-Assay kommen, der ursprünglich als Aspergillus-spezifisch galt. In dieser Arbeit konnte der AB135-8-Antikörper generiert werden, bei dem es sich um einen monoklonalen IgM-Antikörper handelt, der ein Fusarium-Glykoantigen erkennt, das sowohl auf der Oberfläche des Pilzes vorhanden ist als auch in dessen Kulturüberstand nachgewiesen werden kann. Da dieser Antikörper in vitro auch eine schwache Reaktion mit Aspergillus zeigte, konnten wir mithilfe einer A. fumigatus-Mutante, die keine Galaktofuranose bilden kann, zeigen, dass es sich bei dem AB135-8-Antigen um ein Galaktofuranose-haltiges-Antigen handelt. Durch Kombination dieses Antikörpers und eines Aspergillus-spezifischen Antikörpers konnten wir eine Methode zur histopathologischen Unterscheidung von Aspergillus- und Fusarium-Infektionen etablieren. Des Weiteren konnten wir zeigen, dass das AB135-8-Antigen auch im Kulturüberstand vorhanden ist, was die Möglichkeit bietet, einen Sandwich-ELISA für den serologischen Nachweis zu entwickeln, wodurch eine frühzeitige Diagnostik ermöglicht würde. Um neue antifungale Therapiestrategien zu finden, wurde im zweiten Teil dieser Arbeit untersucht, ob Substanzen, die den Pilz-spezifischen High-Osmolarity-Glycerol- (HOG) Signalweg aktivieren, einen geeigneten Ansatz bieten. Der HOG-Signalweg dient der Stresswahrnehmung des Pilzes und hilft u.a. bei der Aufrechterhaltung des osmotischen Gleichgewichts. Fludioxonil und Iprodione aktivieren diesen Signalweg und zeigten in unseren Tests eine klare antifungale Wirkung nicht nur auf Aspergillus, sondern auch auf Lichtheimia, Rhizopus und Scedosporium. Diese spielen als emerging pathogens eine immer größere Rolle bei invasiven Mykosen und sind aufgrund von Resistenzen gegenüber vielen Antimykotika noch schwerer zu behandeln als Aspergillus. Die genaue Wirkung von Fludioxonil und Iprodione haben wir beispielhaft für A. fumigatus untersucht und herausgefunden, dass diese Substanzen zunächst zu einem sofortigen Wachstumsstop führen und dass bei andauernder Exposition der größte Teil der Hyphen auch abgetötet wird. Es kommt bei Fludioxonilzugabe zum Anschwellen der Hyphen, woraufhin der Pilz mit Septenbildung und Verschluss der septalen Poren reagiert. Außerdem werden die Kontrollmechanismen der Mitose durch Fludioxonil ausgeschaltet und es kommt zur Akkumulation von Zellkernen. Auf den durch diese verschiedenen Prozesse ausgelösten Stress reagiert der Pilz u.a. mit einer Umstrukturierung der Zellwand, die mit einer massiven Galaktomannan-Freisetzung einhergeht. Diese induzierte Freisetzung des Galaktomannan-Antigens könnte die Diagnostik im frühen Infektionsstadium deutlich verbessern. HOG-aktivierende Substanzen zeigten sich durch ihre vielfältige zellbiologische Wirkungsweise und ein Zielprotein, das in Säugetieren nicht existiert, als vielversprechende Kandidaten für die Entwicklung neuer Antimykotika zur Bekämpfung von Schimmelpilzinfektionen.

Abstract

The incidence of invasive fungal diseases is increasing worldwide and there are already as many people dying of the top ten of invasive mycoses as of tuberculosis and malaria. Patients undergoing solid-organ or stem cell transplantation, patients under the influence of chemo- or immunosuppressive therapy and patients with AIDS are at high risk of developing invasive fungal diseases. Aspergillus, especially A. fumigatus, is still the most common mold causing invasive fungal infections, but infections caused by non-Aspergillus-molds such as Fusarium spp., Scedosporium spp., Penicillium spp. and different Zygomycetes are on the rise. The characteristically high mortality rates of invasive mycoses are due to shortcomings in the fields of diagnostics and therapy. On the one hand safe and fast methods for the detection and especially for the differentiation of molds are missing. On the other hand not many antifungal agents exist on the market and they also show variable efficacies against the different fungi. Thus, the need for improved diagnostics for differentiation of fungal pathogens as well as new antifungal strategies to combat fungal infections is high. In the first part of this work antibodies against non-Aspergillus-molds were generated to develop new diagnostic methods. We were in particular interested to find a method for the differentiation between an Aspergillus and a Fusarium infection. This still remains a problem, because both fungi have a similar histological morphology, which makes it nearly impossible to discriminate between the two in histology. Moreover the value of a posititve culture is controversial and cross-reactions in the originally Aspergillus specific thought of galactomannan assay have been reported. In this work we generated the AB135-8 antibody, a monoclonal antibody that recognizes a Fusarium glycoantigen present on the hyphal surface but also released in the culture supernatant. This antibody showed also a weak reactivity with A. fumigatus in-vitro, but no reactivity with an A. fumigatus mutant lacking galactofuranose. This strongly suggests, that galactofuranose is an important component of the AB135-8 antigen. By using a combination of this antibody and another Aspergillus specific antibody, we established a method to differentiate between Aspergillus and Fusarium in histopathological samples. Moreover we could show that the AB135-8 antigen is present in culture supernatants, and thus could be a promising target for a Fusarium-specific serological assay, which would enable an earlier detection of Fusarium infections. The second part of this work concentrated on the development of a new antifungal strategy, particularly on the question whether substances activating the fungal specific high osmolarity glycerol (HOG) pathway are a means to combat invasive mycoses. In fungi, the HOG pathway plays an important role for stress sensing and helps amongst others maintaining the osmotic balance. Fludioxonil and Iprodione are activating this pathway and showed in our tests antifungal effects not just on Aspergillus, but also on Lichtheimia, Rhizopus and Scedosporium. These fungi are emerging pathogens causing invasive fungal diseases of increasing importance and are due to their variable resistance to most antifungal agents even more challenging to treat. We have examined the impact of Fludioxonil and Iprodione on A. fumigatus as a model organism and found out that they are first of all inducing an immediate growth arrest, which was followed by a quantitative killing of hyphae. After addition of Fludioxonil, hyphae started to swell and the fungi reacted with an enhanced septum formation and closure of septal pores. Furthermore the control mechanisms of mitosis were disabled by Fludioxonil and nuclei accumulated in the cells. The fungi reacted to the enhanced stress by restructuring their cell wall, which provokes a massive release of galactomannan. This induced galactomannan release could improve the diagnostics at an early stage of infection. HOG activating agents showed a high negative impact on the cell biology and act on a target protein that does not exist in mammals. Thus they are promising candidates for the development of new antifungals to combat mold infections.