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CREB-Phosphorylierung und CRE-Aktivierung in murinen Hypothalamuszellen
CREB-Phosphorylierung und CRE-Aktivierung in murinen Hypothalamuszellen
Der Transkriptionsfaktor cAMP response element-binding protein (CREB) ist an einer Vielzahl zellulärer Prozesse beteiligt, darunter auch an der Appetitregulation im Hypothalamus. Für die Regulation des Appetits ist die Phosphorylierung von CREB durch das anorexigene α-Melanozyten-stimulierende Hormon (α-MSH) von essentieller Bedeutung, da diese Phosphorylierung mit einer Aktivierung von CRE-abhängiger Genexpression gleichgesetzt wird. Eine α-MSH-induzierte CREB-Phosphorylierung konnte im rekombinanten Zellsystem und in vivo gezeigt werden. Im Gegensatz dazu wird eine Rolle für die cAMP-abhängige Proteinkinase A (PKA) bei der CREB-Phosphorylierung und ein Zusammenhang zwischen der CREB-Phosphorylierung und CRE-abhängiger Genexpression nur postuliert. Es fehlen experimentelle Nachweise, da die Untersuchung dieser intrazellulären Signalkaskaden in vivo nur bedingt möglich ist und ein geeignetes Zellmodell bislang fehlte. Ziel dieser Arbeit war es, anhand eines geeigneten Zellmodells die α-MSH-induzierte Signalkaskade detailliert zu analysieren. In dieser Arbeit konnte für hypothalamische mHypoA-2/10-CRE-Zellen der Maus erstmals gezeigt werden, dass nicht die PKA, sondern die extracellular signal-regulated kinases-1/2 (ERK-1/2) die zuständigen Kinasen für die CREB-Phosphorylierung und CRE-Aktivierung durch α-MSH sind. Zur weiteren Vervollständigung der Signalkaskade wurde zum ersten Mal gezeigt, dass die α-MSH-vermittelte Phosphorylierung von ERK-1/2 vom exchange factor directly activated by cAMP (EPAC) abhängig war. Die Bedeutung der EPAC/ERK- 1/2/CREB Signalkaskade konnte durch eigene Daten aus murinen GT1-7-Zellen und humanen HEK-293-Zellen gestützt werden. Da die α-MSH-vermittelte Expression des physiologisch relevanten, CREB-abhängigen Gens für das Thyreotropin Releasing Hormon (TRH) auch von EPAC abhängig war, kann die α-MSH-induzierte EPAC/ERK-1/2/CREB-Signalkaskade für die Behandlung der Adipositas interessant sein. In dieser Arbeit wurden weitere Hormone identifiziert, die im hypothalamischen Zellmodell CREB phosphorylieren. Für Bradykinin wurde sowohl für die CREB-Phosphorylierung als auch für die CRE-Reporteraktivierung gezeigt, dass beide Ereignisse durch die Proteinkinase C vermittelt werden. Interessanterweise war die CREB-Phosphorylierung durch 5-Hydroxytryptamin und Wachstumsfaktoren (EGF, IGF und NGF), ähnlich zu α-MSH, ERK-1/2-abhängig, jedoch führte diese Modulation von CREB nicht zu einer Erhöhung der CRE-Reporteraktivität. Diese Ergebnisse zeigen, dass die CREB-Phosphorylierung in hypothalamischen Zellen nicht mit einer CRE-Aktivierung gleichgesetzt werden kann und die Untersuchung der CREB-Phosphorylierung nicht ausreichend ist, um auf eine CRE-abhängige Genexpression in vivo zu schließen., α-Melanocyte-stimulating hormone (α-MSH)-induced phosphorylation of the cAMP response element-binding protein (CREB) at serin 133 is an important event in hypothalamic appetite regulation and appears to be connected with CRE-dependent gene expression. α-MSH-induced phosphorylation of CREB has been shown in numerous recombinant cell models as well as in vivo, but the role of cAMP-dependent protein kinase A (PKA) in this process has not been rigorously worked out experimentally. Furthermore, experiments showing the connection between CREB phosphorylation and hypothalamic CRE activation are missing. So far the analysis of these intracellular signaling pathways was hindered, due to the lack of suitable cell models. The aim of this work was to characterize α-MSH-induced CREB/CRE activation in detail by using appropriate hypothalamic cell models. Analysis of the hypothalamic murine cell line mHypoA-2/10-CRE revealed that extracellular signal-regulated kinases-1/2 (ERK-1/2) and not PKA are responsible for α-MSH-induced CREB phosphorylation and CRE activation. Additionally, exchange factors directly activated by cAMP (EPAC) were identified as the molecular connection between the α-MSH-bound receptor and ERK-1/2. The significance of this new EPAC/ERK-1/2/CREB signaling pathway was shown in murine GT1-7 and human HEK-293 cells. α-MSH-induced EPAC/ERK-1/2/CREB signaling pathways could be useful for developing anti-obesity drugs, because α-MSH-induced expression of TRH, which is physiologically relevant for energy homeostasis, was also found to be EPAC-dependent. The presented work revealed for the first time that other hormones besides α-MSH also phosphorylate CREB in hypothalamic cells. For example, bradykinin-induced CREB phos- phorylation and CRE activation was found to be dependent on proteine kinase C activity. Of note, no ligand-induced CRE activation was detectable although CREB phosphorylation induced by 5-hydroxytryptamine or growth factors (EGF, IGF and NGF) was, as with α-MSH, dependent on ERK-1/2 activity. These results strongly suggest that hypothalamic CREB phosphorylation does not necessarily lead to CRE-dependent gene expression. Hence, monitoring CREB phosphorylation is not sufficient to make conclusions on CRE-dependent gene expression in vivo.
CREB, CRE, Hypothalamus, Appetitregulation
Glas, Evi
2017
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Glas, Evi (2017): CREB-Phosphorylierung und CRE-Aktivierung in murinen Hypothalamuszellen. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Der Transkriptionsfaktor cAMP response element-binding protein (CREB) ist an einer Vielzahl zellulärer Prozesse beteiligt, darunter auch an der Appetitregulation im Hypothalamus. Für die Regulation des Appetits ist die Phosphorylierung von CREB durch das anorexigene α-Melanozyten-stimulierende Hormon (α-MSH) von essentieller Bedeutung, da diese Phosphorylierung mit einer Aktivierung von CRE-abhängiger Genexpression gleichgesetzt wird. Eine α-MSH-induzierte CREB-Phosphorylierung konnte im rekombinanten Zellsystem und in vivo gezeigt werden. Im Gegensatz dazu wird eine Rolle für die cAMP-abhängige Proteinkinase A (PKA) bei der CREB-Phosphorylierung und ein Zusammenhang zwischen der CREB-Phosphorylierung und CRE-abhängiger Genexpression nur postuliert. Es fehlen experimentelle Nachweise, da die Untersuchung dieser intrazellulären Signalkaskaden in vivo nur bedingt möglich ist und ein geeignetes Zellmodell bislang fehlte. Ziel dieser Arbeit war es, anhand eines geeigneten Zellmodells die α-MSH-induzierte Signalkaskade detailliert zu analysieren. In dieser Arbeit konnte für hypothalamische mHypoA-2/10-CRE-Zellen der Maus erstmals gezeigt werden, dass nicht die PKA, sondern die extracellular signal-regulated kinases-1/2 (ERK-1/2) die zuständigen Kinasen für die CREB-Phosphorylierung und CRE-Aktivierung durch α-MSH sind. Zur weiteren Vervollständigung der Signalkaskade wurde zum ersten Mal gezeigt, dass die α-MSH-vermittelte Phosphorylierung von ERK-1/2 vom exchange factor directly activated by cAMP (EPAC) abhängig war. Die Bedeutung der EPAC/ERK- 1/2/CREB Signalkaskade konnte durch eigene Daten aus murinen GT1-7-Zellen und humanen HEK-293-Zellen gestützt werden. Da die α-MSH-vermittelte Expression des physiologisch relevanten, CREB-abhängigen Gens für das Thyreotropin Releasing Hormon (TRH) auch von EPAC abhängig war, kann die α-MSH-induzierte EPAC/ERK-1/2/CREB-Signalkaskade für die Behandlung der Adipositas interessant sein. In dieser Arbeit wurden weitere Hormone identifiziert, die im hypothalamischen Zellmodell CREB phosphorylieren. Für Bradykinin wurde sowohl für die CREB-Phosphorylierung als auch für die CRE-Reporteraktivierung gezeigt, dass beide Ereignisse durch die Proteinkinase C vermittelt werden. Interessanterweise war die CREB-Phosphorylierung durch 5-Hydroxytryptamin und Wachstumsfaktoren (EGF, IGF und NGF), ähnlich zu α-MSH, ERK-1/2-abhängig, jedoch führte diese Modulation von CREB nicht zu einer Erhöhung der CRE-Reporteraktivität. Diese Ergebnisse zeigen, dass die CREB-Phosphorylierung in hypothalamischen Zellen nicht mit einer CRE-Aktivierung gleichgesetzt werden kann und die Untersuchung der CREB-Phosphorylierung nicht ausreichend ist, um auf eine CRE-abhängige Genexpression in vivo zu schließen.

Abstract

α-Melanocyte-stimulating hormone (α-MSH)-induced phosphorylation of the cAMP response element-binding protein (CREB) at serin 133 is an important event in hypothalamic appetite regulation and appears to be connected with CRE-dependent gene expression. α-MSH-induced phosphorylation of CREB has been shown in numerous recombinant cell models as well as in vivo, but the role of cAMP-dependent protein kinase A (PKA) in this process has not been rigorously worked out experimentally. Furthermore, experiments showing the connection between CREB phosphorylation and hypothalamic CRE activation are missing. So far the analysis of these intracellular signaling pathways was hindered, due to the lack of suitable cell models. The aim of this work was to characterize α-MSH-induced CREB/CRE activation in detail by using appropriate hypothalamic cell models. Analysis of the hypothalamic murine cell line mHypoA-2/10-CRE revealed that extracellular signal-regulated kinases-1/2 (ERK-1/2) and not PKA are responsible for α-MSH-induced CREB phosphorylation and CRE activation. Additionally, exchange factors directly activated by cAMP (EPAC) were identified as the molecular connection between the α-MSH-bound receptor and ERK-1/2. The significance of this new EPAC/ERK-1/2/CREB signaling pathway was shown in murine GT1-7 and human HEK-293 cells. α-MSH-induced EPAC/ERK-1/2/CREB signaling pathways could be useful for developing anti-obesity drugs, because α-MSH-induced expression of TRH, which is physiologically relevant for energy homeostasis, was also found to be EPAC-dependent. The presented work revealed for the first time that other hormones besides α-MSH also phosphorylate CREB in hypothalamic cells. For example, bradykinin-induced CREB phos- phorylation and CRE activation was found to be dependent on proteine kinase C activity. Of note, no ligand-induced CRE activation was detectable although CREB phosphorylation induced by 5-hydroxytryptamine or growth factors (EGF, IGF and NGF) was, as with α-MSH, dependent on ERK-1/2 activity. These results strongly suggest that hypothalamic CREB phosphorylation does not necessarily lead to CRE-dependent gene expression. Hence, monitoring CREB phosphorylation is not sufficient to make conclusions on CRE-dependent gene expression in vivo.