Logo Logo
Help
Contact
Switch language to German
Detektion bakterieller Nukleinsäuren im Atemkondensat am Beispiel von Pseudomonas aeruginosa bei CF-Patienten
Detektion bakterieller Nukleinsäuren im Atemkondensat am Beispiel von Pseudomonas aeruginosa bei CF-Patienten
Ziel dieser Studie war es, in EBC von an CF erkrankten Patienten Nukleinsäuren von P. aeruginosa mit Hilfe biochemischer Methoden zu detektieren. Hierzu wurde zuerst untersucht, ob im Sputum und EBC endogene Nukleasen enthalten sind. Zunächst wurden vierzehn Sputumproben von CF-Patienten nach einem standardisierten Protokoll gesammelt und aufbereitet. Darauffolgend wurden einundzwanzig EBCProben von einem anderen CF-Patientenkollektiv gewonnen. Von diesen wiesen zwölf Patienten einen positiven P. aeruginosa-Nachweis in der zuletzt durchgeführten Sputumkultur auf. Zur Untersuchung von RNasen bzw. DNasen im Sputum oder EBC wurde den Atemwegssekreten RNA bzw. DNA zugesetzt und inkubiert. Für den Nachweis von P. aeruginosa-DNA in EBC und Sputum wurde eine PCR durchgeführt. Zur Detektion von P. aeruginosa-RNA erfolgte vor der PCR ein DNase-Verdau sowie eine RT. Es wurde jeweils die Nachweisgrenze ermittelt. Außerdem fand ein Test auf Inhibitoren der PCR und RT-PCR statt. Beim Nukleasenachweis wiesen alle vierzehn Sputumproben nach 15 Minuten Reaktionszeit eine starke RNase-Aktivität auf. In fünfzehn EBC-Proben hingegen konnte nach 20-stündiger Inkubation allenfalls eine geringe RNase-Aktivität festgestellt werden, unabhängig davon, ob es sich um Proben gesunder Labormitarbeiter oder CF-Patienten mit und ohne P. aeruginosa-Besiedelung handelte. Zwei der vierzehn Sputumproben zeigten eine starke, zehn eine mittlere und zwei keine DNase-Aktivität (20-stündige Inkubationszeit). Die EBC-Proben waren nach 20 Stunden Reaktionszeit frei von DNase-Aktivität. Es ergab sich kein Unterschied zwischen gesunden und CF-Probanden. Der Nukleinsäurenachweis mittels RT-PCR und PCR ergab in zwölf EBC-Proben weder mit dem Ps. ae.- noch mit dem Ps. sp.-Primerpaar einen positiven Nachweis von P. aeruginosa- RNA oder -DNA bei P. aeruginosa-positiven CF-Patienten. Die Nachweisgrenze für die Detektion von P. aeruginosa-RNA mit dem Ps. ae.-Primerpaar wurde mittels einer Verdünnungsreihe auf 2,14 ng festgelegt. Beim Nachweis von P. aeruginosa-DNA lag sie bei einem Wert von 0,15 ng. In keinem der zwölf getesteten EBCs konnten Inhibitoren der RT-PCR oder PCR detektiert werden. Keine der vierzehn Sputum-Proben von CF-Patienten wies einen positiven P. aeruginosa-RNA-Nachweis mit dem Ps. ae.-Primerpaar auf. In sieben Sputumproben wurde mit Hilfe des Ps. ae.-Primerpaares P. aeruginosa-DNA detektiert. Die hohe RNase-Aktivität im Sputum von CF-Patienten stellt ein entscheidendes Hindernis für die pulmonale Applikation von In-vitro-Transfektions-RNA dar. Bei Kindern wäre die Inhalationstherapie gegenüber einer Verabreichung mittels Spritze vorzuziehen. Für eine effektive Transfektion müssten deshalb zusätzliche Vorkehrungen wie die Zugabe von komplexbildenden Agentien getroffen werden. Die Resultate der RT-PCR und PCR unterstützen in Zusammenschau mit den Ergebnissen anderer Studien die These, dass für einen positiven Nukleinsäurenachweis im EBC zwei Schritte entscheidend sind. Zum einen ist das die Zugabe von Nukleaseinhibitoren direkt nach der Probengewinnung und zum anderen die Extraktion der im EBC enthaltenen DNA. Auf diese Weise könnte sich die EBC-Analyse zu einem interessanten diagnostischen Werkzeug entwickeln, welches die nicht-invasive Frühdetektion von Infektionen der Lunge ermöglichen würde. Insbesondere Kinder, welche häufig kein Sputum abgeben können, da sie es hinunterschlucken, würden von diesem Verfahren profitieren. Ein ebenso bedeutender Anwendungsbereich stellt die Diagnostik der Tuberkulose dar. Es ist denkbar, dass eine einfach und schnell durchzuführende EBC-Diagnostik die langen Wartezeiten bei der Anzucht von Sputumkulturen ablösen könnte.
EBC, Atemkondensat, Pseudomonas aeruginosa, Cystische Fibrose, Sputum
Wenzel, Lisa
2016
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Wenzel, Lisa (2016): Detektion bakterieller Nukleinsäuren im Atemkondensat am Beispiel von Pseudomonas aeruginosa bei CF-Patienten. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
[img]
Preview
PDF
Wenzel_Lisa.pdf

3MB

Abstract

Ziel dieser Studie war es, in EBC von an CF erkrankten Patienten Nukleinsäuren von P. aeruginosa mit Hilfe biochemischer Methoden zu detektieren. Hierzu wurde zuerst untersucht, ob im Sputum und EBC endogene Nukleasen enthalten sind. Zunächst wurden vierzehn Sputumproben von CF-Patienten nach einem standardisierten Protokoll gesammelt und aufbereitet. Darauffolgend wurden einundzwanzig EBCProben von einem anderen CF-Patientenkollektiv gewonnen. Von diesen wiesen zwölf Patienten einen positiven P. aeruginosa-Nachweis in der zuletzt durchgeführten Sputumkultur auf. Zur Untersuchung von RNasen bzw. DNasen im Sputum oder EBC wurde den Atemwegssekreten RNA bzw. DNA zugesetzt und inkubiert. Für den Nachweis von P. aeruginosa-DNA in EBC und Sputum wurde eine PCR durchgeführt. Zur Detektion von P. aeruginosa-RNA erfolgte vor der PCR ein DNase-Verdau sowie eine RT. Es wurde jeweils die Nachweisgrenze ermittelt. Außerdem fand ein Test auf Inhibitoren der PCR und RT-PCR statt. Beim Nukleasenachweis wiesen alle vierzehn Sputumproben nach 15 Minuten Reaktionszeit eine starke RNase-Aktivität auf. In fünfzehn EBC-Proben hingegen konnte nach 20-stündiger Inkubation allenfalls eine geringe RNase-Aktivität festgestellt werden, unabhängig davon, ob es sich um Proben gesunder Labormitarbeiter oder CF-Patienten mit und ohne P. aeruginosa-Besiedelung handelte. Zwei der vierzehn Sputumproben zeigten eine starke, zehn eine mittlere und zwei keine DNase-Aktivität (20-stündige Inkubationszeit). Die EBC-Proben waren nach 20 Stunden Reaktionszeit frei von DNase-Aktivität. Es ergab sich kein Unterschied zwischen gesunden und CF-Probanden. Der Nukleinsäurenachweis mittels RT-PCR und PCR ergab in zwölf EBC-Proben weder mit dem Ps. ae.- noch mit dem Ps. sp.-Primerpaar einen positiven Nachweis von P. aeruginosa- RNA oder -DNA bei P. aeruginosa-positiven CF-Patienten. Die Nachweisgrenze für die Detektion von P. aeruginosa-RNA mit dem Ps. ae.-Primerpaar wurde mittels einer Verdünnungsreihe auf 2,14 ng festgelegt. Beim Nachweis von P. aeruginosa-DNA lag sie bei einem Wert von 0,15 ng. In keinem der zwölf getesteten EBCs konnten Inhibitoren der RT-PCR oder PCR detektiert werden. Keine der vierzehn Sputum-Proben von CF-Patienten wies einen positiven P. aeruginosa-RNA-Nachweis mit dem Ps. ae.-Primerpaar auf. In sieben Sputumproben wurde mit Hilfe des Ps. ae.-Primerpaares P. aeruginosa-DNA detektiert. Die hohe RNase-Aktivität im Sputum von CF-Patienten stellt ein entscheidendes Hindernis für die pulmonale Applikation von In-vitro-Transfektions-RNA dar. Bei Kindern wäre die Inhalationstherapie gegenüber einer Verabreichung mittels Spritze vorzuziehen. Für eine effektive Transfektion müssten deshalb zusätzliche Vorkehrungen wie die Zugabe von komplexbildenden Agentien getroffen werden. Die Resultate der RT-PCR und PCR unterstützen in Zusammenschau mit den Ergebnissen anderer Studien die These, dass für einen positiven Nukleinsäurenachweis im EBC zwei Schritte entscheidend sind. Zum einen ist das die Zugabe von Nukleaseinhibitoren direkt nach der Probengewinnung und zum anderen die Extraktion der im EBC enthaltenen DNA. Auf diese Weise könnte sich die EBC-Analyse zu einem interessanten diagnostischen Werkzeug entwickeln, welches die nicht-invasive Frühdetektion von Infektionen der Lunge ermöglichen würde. Insbesondere Kinder, welche häufig kein Sputum abgeben können, da sie es hinunterschlucken, würden von diesem Verfahren profitieren. Ein ebenso bedeutender Anwendungsbereich stellt die Diagnostik der Tuberkulose dar. Es ist denkbar, dass eine einfach und schnell durchzuführende EBC-Diagnostik die langen Wartezeiten bei der Anzucht von Sputumkulturen ablösen könnte.