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Berschneider, Korbinian (2016): Connecting the functions of the proteasome and mitochondria in the lung. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät
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Abstract

Das Proteom lebender Zellen befindet sich im ständigen Umbau, da zelluläre Proteine beschädigt werden und abgebaut werden müssen oder Zellen sich an veränderte physiologische Bedingungen anpassen. Die zellulären Prozesse, die den Erhalt des funktionalen Proteoms garantieren, werden unter dem Begriff Proteostase zusammengefasst. Das Proteasom stellt dabei eines der bedeutendsten intrazellulären Abbausysteme für beschädigte oder nicht benötigte Proteine dar. Insbesondere fehlgefaltete Proteine müssen zeitnah abgebaut werden um proteotoxische Effekte, wie zum Beispiel die Bildung von Proteinaggregaten zu vermeiden. Der Abbau zellulärer Proteine durch das Proteasom stellt einen sehr energieaufwändigen Prozess in der Zelle dar. Dementsprechend gibt es Hinweise auf eine Verknüpfung und wechselseitige Regulation zwischen den bedeutendsten Energieproduzenten der Zelle, den Mitochondrien, und proteasomaler Aktivität. Darüber hinaus korreliert proteasomale Dysfunktion mit mitochondrialer Fehlfunktion im Rahmen von Alterungsprozessen. Es ist allerdings wenig darüber bekannt, inwieweit mitochondriale Funktion und proteasomale Aktivität direkt miteinander verknüpft sind, vor allem im Kontext chronischer Defekte der mitochondrialen Atmungskette. Darüber hinaus ist weitgehend unbekannt, in welchem Ausmaß diese Prozesse spezifisch zur Lungenalterung oder zur Entwicklung von altersbedingten Lungenkrankheiten wie der chronisch obstruktiven Lungenerkrankung beitragen. Im ersten Teil dieser Studie wurde die Verknüpfung zwischen mitochondrialer Fehlfunktion und der proteasomalen Aktivität analysiert. Hierfür wurde die proteasomale Funktion in sogenannten „mtDNA mutator Mäusen“, einem Model für chronische Fehlfunktion der mitochondrialen Atmungskette, untersucht. Eine verminderte Proteasomaktivität und eine Reduktion der Anzahl von 26S und 30S Proteasomen in embryonalen Fibroblasten dieser Mäuse bestätigten eine enge Verknüpfung von mitochondrialer und proteasomaler Funktion. Eine verminderte Proteasomfunktion wurde darüber hinaus auch in dermalen Fibroblasten von Patienten gezeigt, die einzelne definierte Mutationen in Genen der mitochondrialen Atmungskette aufweisen. Zusätzlich wurde herausgefunden, dass zu den bereits beschriebenen Signalwegen, weitere regulatorische Mechanismen existieren, die mitochondriale und proteasomale Funktion miteinander verknüpfen. Um zu untersuchen inwieweit Umwelteinflüsse die mitochondriale Funktion in der Lunge beeinflussen, wurde im zweiten Teil der Studie der Effekt von Zigarettenrauch auf mitochondriale Funktion und Qualitätskontrolle in Lungenepithelzellen bestimmt. Alveoläre Epithelzellen der Maus zeigten eine deutliche Hyperfusion der Mitochondrien und eine begleitende Erhöhung der metabolischen Aktivität nach der Behandlung mit Zigarettenrauchextrakt. Die durch Zigarettenrauchextrakt induzierte mitochondriale Hyperfusion war jedoch nicht mit einer proteostatischen Veränderung der Mitochondrien verknüpft. Darüber hinaus wurde In dieser Studie keine Beeinflussung der mitochondrialen Proteinqualitätskontrolle durch das Proteasom festgestellt. Mitochondriale Hyperfusion scheint daher eine überlebensfördernde Anpassung von alveolären Epithelzellen an nicht-toxische Konzentrationen von Zigarettenrauchextrakt darzustellen. Im letzten Teil der Studie wurde die Rolle beider Systeme, Proteasom und Mitochondrien, im Rahmen der Lungenalterung untersucht. Dazu wurden Alterungsprozesse sowie proteasomale Funktion in der Lunge von jungen und alten Wildtyp-Mäusen, Proteasom Reporter-Mäusen und Immunoproteasom Knockout Mäusen untersucht. Dabei wurde beobachtet, dass die Untereinheiten des Immunoproteasoms in Lungen alter Mäusen hochreguliert waren und dementsprechend die Caspase-ähnliche Aktivität des Proteasoms vermindert war. Knockout-Mäuse für die Immunoproteasom Untereinheiten LMP2 oder LMP7 waren jedoch vor physiologischer Lungenalterung nicht geschützt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die veränderte Funktion des Immunoproteasoms nicht ausschlaggebend für die physiologische Lungenalterung ist. Weiterhin deuten sie darauf hin, dass die Alterungsprozesse in gesunden Lungen keine Veränderung der proteasomalen Funktion einschließen. Darüber hinaus wurde in frühzeitig alternden mtDNA mutator Mäusen keine Verknüpfung zwischen mitochondrialer Fehlfunktion und physiologischer Lungenalterung gefunden. Zusammenfassend bestätigt diese Studie die Hypothese, dass proteasomale und mitochondriale Funktion eng miteinander verknüpft sind. Darüber hinaus wird gezeigt, dass sowohl das mitochondriale wie auch das proteasomale System Reservekapazitäten haben, die sie dazu befähigen trotz milder Beanspruchungen durch Umwelteinflüsse oder während physiologischer Alterungsprozessen funktionsfähig zu bleiben. Da jedoch beide Systeme eng miteinander verbunden sind könnten bei einer kumulativen Belastung durch altersbedingte Fehlfunktion und Exposition mit schädlichen Umwelteinflüssen, wie z.B. Zigarettenrauch, mitochondriale und proteasomale Fehlfunktion einen Grenzwert überschreiten und somit zu vorzeitigen Alterungsprozessen und der Entwicklung von altersbedingten Krankheiten beitragen.

Abstract

In living cells the cellular proteome is under constant remodeling as cells adapt to altered physiological states or as cellular proteins become misfolded and need to be degraded. The cellular processes which grant maintenance of a functional proteome are collectively called proteostasis. The proteasome constitutes one of the major intracellular protein degradation systems and is responsible for the turnover of damaged or unwanted proteins with almost 90% of the intracellular proteins being potential proteasome substrates. Especially for misfolded proteins, a timely degradation is necessary to avoid proteotoxic stress, e.g. by formation of protein aggregates. Degradation of proteins by the proteasome system is a very energy demanding process. Hence it was speculated that proteasomal function is interconnected with the function of mitochondria. Additionally, a correlation between mitochondrial and proteasomal dysfunction exists since a decline in the function of both systems is well recognized as hallmark of aging. However, it is unclear how proteasomal and mitochondrial function are directly linked together, especially in settings of chronic mitochondrial respiratory chain dysfunction. Moreover, limited knowledge is available to which extent proteasomal and mitochondrial functions contribute to aging processes specifically in lung tissue during healthy aging or in the development of age-related lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease. In the first part of this study, the connection between mitochondrial dysfunction and the proteasome was assessed by analyzing proteasome function in the so-called “mtDNA mutator” mouse model, a model of chronic mitochondrial respiratory chain dysfunction. A strong interconnection between mitochondrial and proteasomal function was confirmed in mouse embryonic fibroblasts of mtDNA mutator mice as in these cells decreased proteasomal activity and reduced levels of assembled 26S and 30S proteasomes was found based on a pronounced mitochondrial respiratory chain dysfunction. Importantly, human dermal fibroblasts from patients with single mutations in mitochondrial genes accordingly showed reduced proteasome activity. Furthermore, it was shown that in addition to acute regulation by reactive oxygen species or ATP levels, further signaling mechanisms exist, which connect mitochondrial and proteasomal function in chronic settings. Second, to assess mitochondrial alterations in response to environmental challenges in the lung, the effect of cigarette smoke exposure on mitochondrial function and quality control in alveolar epithelial cells was analyzed. Murine alveolar epithelial cells exhibited pronounced mitochondrial hyperfusion after treatment with cigarette smoke extract, which was accompanied by increased metabolic activity. Cigarette smoke extract-induced mitochondrial hyperfusion was not associated with a protein stress response at mitochondria. Furthermore, no alteration in mitochondrial protein quality control by the proteasome was observed. Therefore, mitochondrial hyperfusion seems to be an adaptive pro-survival response of alveolar epithelial cell mitochondria to nontoxic concentrations of cigarette smoke extract. Finally, the specific involvement of both systems, proteasome and mitochondria, in healthy aging of the lung was assessed. Therefore typical features of healthy lung aging and proteasome function were analyzed in young and aged wildtype, proteasome reporter and immunoproteasome knockout mice. Hereby, it was observed that immunoproteasome subunits were upregulated in the lungs of aged mice and the caspase-like proteasome activity was concomitantly decreased. However, aged knockout mice for the immunoproteasome subunits LMP2 or LMP7 showed no alteration in proteasome activities while exhibiting typical lung aging phenotypes. This suggests that immunoproteasome function is dispensable for physiological lung aging in mice. These results indicate that healthy aging of the lung does not involve impairment of proteasome function. Furthermore, no connection between mitochondrial dysfunction and lung aging was found in prematurely aging mtDNA mutator mice. Altogether, this study confirms the hypothesis that the functions of the proteasome and mitochondria are closely connected. Furthermore, it shows that mitochondria as well as the proteasome system provide some spare capacity, which enables them to remain functional upon mild insults during healthy aging or exposure to mild environmental hazards. However, due to the close interconnection of both systems, the simultaneous burden of an age-related functional decline together with noxious environmental exposures such as cigarette smoke might push proteasomal and mitochondrial dysfunction beyond a damage threshold thereby contributing to the pathogenesis of disease states or to a combined functional decline of both systems as described in aging.