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Manske, Christian (2016): Metabolism of glycerol and inositol by Legionella pneumophila. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät
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Abstract

Legionella pneumophila is a gram-negative, opportunistic pathogen that naturally parasitizes environmental amoeba, but can also infect human alveolar macrophages, thus causing a severe and potentially lethal pneumonia called “Legionnaires’ disease”. L. pneumophila is an obligate aerobe organism that prefers amino acids as main source of carbon and energy. Nevertheless, the genome of Legionella encodes complete pathways that are needed for carbohydrate catabolism, making it possible that more substrates besides amino acids are used for nutrition by the bacteria. In this study a novel growth medium was designed and used to investigate the metabolism of glycerol and inositol by L. pneumophila. Previous studies of the transcriptome of L. pneumophila growing inside macrophages revealed that the expression of glycerol kinase (lpg1414) and glycerol-3-phosphate dehydrogenase (glpD) was highly upregulated compared to extracellular growing bacteria (Faucher et al., 2011). In line with this study, we found that glycerol did not enhance extracellular growth of L. pneumophila. However, glycerol did promote intracellular growth in Acanthamoeba castellanii and macrophages in a glpD-dependent manner, and a glpD deletion mutant had a severe growth disadvantage compared to wild-type bacteria. Isotopologue profiling experiments with [U-13C3]glycerol, [U-13C6]glucose or [U-13C3]serine as precursors revealed that all three carbon sources were metabolized by L. pneumophila. Glycerol and glucose were mainly used to synthesize mannose and histidine, which proved that gluconeogenesis and the PPP are active in L. pneumophila, while serine was mainly used in the glycolytic pathway and the TCA cycle for energy generation. This work revealed that L. pneumophila employs a bipartite metabolism, where serine is used for energy generation, while glucose and glycerol are exclusively used for anabolic purposes. This metabolic concept seems also to apply for intracellularly growing L. pneumophila and other intracellular pathogens. Furthermore, the genome of L. pneumophila harbors a cluster of genes with homologies to genes implicated in inositol metabolism in other prokaryotes. These genes were also shown to be upregulated upon infection of macrophages (Faucher et al., 2011). In this work, the first protein of this cluster, Lpg1653, was identified as inositol transporter, as it enabled L. pneumophila to transport 14C-inositol. The transporter was termed IolT, according to inositol transporters in other bacteria. Similar to glycerol, inositol did not enhance extracellular growth in different media, but promoted intracellular growth of L. pneumophila in A. castellanii and murine macrophages, and therefore might also be used as an intracellular carbon source. Interestingly, the expression of iolT was regulated by RpoS, a central regulator of differentiation and virulence genes of L. pneumophila. Taken together, the work outlined in this thesis expanded the understanding of L. pneumophila metabolism and proved that the bacteria can metabolize glycerol and inositol. The concept of a bipartite metabolism that was shown here might be important to understand the intimate relations and interactions between intracellular pathogens and their host cells. These insights might in consequence help to find new therapies for L. pneumophila and other intracellular pathogens.

Abstract

Legionella pneumophila ist ein Gram-negatives, opportunistisches Pathogen, welches natürlicherweise Amöben in der freien Natur parasitiert, aber auch in der Lage ist, Alveolarmakrophagen zu infizieren und dadurch eine schwere und potentiell tödliche Pneumonie, die sogenannte Legionärskrankheit, auslösen kann. L. pneumophila ist ein obligat aerobes Bakterium, das Aminosäuren als bevorzugte Kohlenstoff- und Energiequelle nutzt. Es ist allerdings möglich, dass weitere Substrate neben Aminosäuren den Bakterien als Nahrungsgrundlage dienen, da im Genom der Legionellen offenbar komplette Stoffwechselwege für den Kohlenhydratmetabolismus kodiert sind. In dieser Arbeit wurde ein neuartiges Wachstumsmedium für Legionellen entwickelt und dazu benutzt, den Glyzerin- und Inositolstoffwechsel von L. pneumophila zu untersuchen. Vorgängige Transkriptomstudien von Legionellen, die intrazellulär in Makrophagen wuchsen, zeigten, dass verglichen mit extrazellulär wachsenden Bakterien, die Expression der Glyzerinkinase (lpg1414) und der Glyzerin-3-Phosphat Dehydrogenase (glpD), stark hochreguliert war (Faucher et al., 2011). Damit übereinstimmend zeigten wir in der vorliegenden Studie, dass Glyzerin keinen Einfluss auf das extrazelluläre Wachstum von L. pneumophila hat, jedoch das intrazelluläre Wachstum in Acanthamoeba castellanii und Makrophagen fördert. Dies war abhängig von GlpD, und eine glpD Deletionsmutante hatte einen schweren Wachstumsnachteil im direkten Vergleich mit Wildtypbakterien. Isotopologisches Profiling mit [U-13C3]Glyzerin, [U-13C6]Glukose oder [U-13C3]Serin als Ausgangssubstanzen zeigte, dass L. pneumophila alle drei Substrate verstoffwechseln kann. Glyzerin und Glukose wurden dazu benutzt, Mannose und Histidin zu synthetisieren, wodurch bewiesen wurde, dass die Glukoneogenese und der Pentosephosphatweg in L. pneumophila ablaufen. Serin anderseits wurde in der Glykolyse und im TCA-Zyklus verwendet, um Energie zu gewinnen. Es konnte dadurch gezeigt werden, dass Legionellen einen zweigeteilten Stoffwechsel betreiben, in dem Serin zur Energiegewinnung und Glukose sowie Glyzerin ausschließlich zu anabolen Zwecken verwendet werden. Dieses Stoffwechselkonzept scheint auch auf intrazellulär wachsende Legionellen und andere intrazelluläre Pathogene anwendbar zu sein. Das Genom von Legionellen enthält eine Gruppe an Genen, die große Homologien zu Genen zeigen, welche in anderen Prokaryoten mit dem Stoffwechsel von Inositol assoziiert sind. Transkriptomstudien zeigten, dass die Expression dieses Clusters in Makrophagen hochreguliert war (Faucher et al., 2011). In der vorliegenden Arbeit wurde das erste Protein dieses Clusters, Lpg1653, als Inositoltransporter identifiziert, da es L. pneumophila erlaubte 14C-Inositol zu transportieren. In Anlehnung an die Namensgebung in anderen Bakterien wurde das Protein IolT genannt. Ähnlich wie Glyzerin, hatte Inositol keinen Einfluss auf das extrazelluläre Wachstum von L. pneumophila, verbesserte aber wiederum das intrazelluläre Wachstum in A. castellanii und Makrophagen. Inositol könnte deshalb als intrazelluläre Kohlenstoff- und Energiequelle verwendet werden. Interessanterweise wurde die Expression von iolT durch RpoS gesteuert, einem der zentralen Regulatoren der Genexpression in L. pneumophila. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die vorliegende Arbeit das Verständnis des Stoffwechsels von L. pneumophila erweitert und nachweist, dass die Bakterien Glyzerin und Inositol verstoffwechseln können. Das Konzept eines zweigeteilten Metabolismus trägt zu einem verbesserten Verständnis der Beziehungen zwischen intrazellulären Pathogenen und ihren Wirtszellen bei. Diese Einsichten könnten nützlich sein, um neue Therapien gegen L. pneumophila und andere intrazelluläre Pathogene zu finden.