Expression und Relevanz von beta-Integrinen, Aktivierungs- und Differenzierungsantigenen auf T-Zellen vor und nach Stimulation mit Dendritischen Zellen leukämischen Ursprungs

Vogt, Valentin (2016): Expression und Relevanz von beta-Integrinen, Aktivierungs- und Differenzierungsantigenen auf T-Zellen vor und nach Stimulation mit Dendritischen Zellen leukämischen Ursprungs. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Die Akute Myeloische Leukämie (AML) ist eine neoplastische Erkrankung der Hämatopoese, welche durch eine übersteigerte Zellproliferation und gestörte Differenzierung der myeloischen Zellreihe charakterisiert ist. Obwohl initiale Chemotherapien hohe Raten an Remissionen erreichen liegt die 4-Jahres-Überlebensrate der Patienten lediglich bei 34%. Stammzelltransplantationen (SZT) und die Gabe von Spenderlymphozyten (DLI) sind vielversprechende kurative Ansätze in der Behandlung der Akuten Myeloischen Leukämie (Jabbour, Estey, and Kantarjian, 2006; Kolb, 2008; Schmid et al., 2012a). T-Zellen sind die Hauptmediatoren der antileukämischen Immunantwort und somit wichtige Effektoren der Immuntherapie (Schmetzer, 2011). Wir und andere Gruppen konnten bereits zeigen, dass Dendritische Zellen leukämischen Ursprungs (DCleu, in der Folge als ‘DC’ abgekürzt) nach Stimulation die antileukämische Funktionalität von T-Zellen verbessern, auch wenn dies nicht in jedem einzelnen Fall gelingt (Grabrucker et al., 2010; Liepert et al., 2010). ‘DC’ wurden mit 4 verschiedenen serumfreien Kulturmedien [‘MCM-Mimic‘, ‘Ca-Ionophore (A 23187) ‘ , ‘Picibanil (OK-432) ‘ und ‘Intron‘] in einem Vorversuch aus blastenhaltigen PB-MNCs generiert und die ergiebigste Methode im ‘Hauptversuch‘ zur quantitativen ‘DC’ Generierung verwendet (Kremser et al., 2010). Die Quantität und Qualität der ‘DC’ und T-Zellen wurde mit Hilfe einer von unserer Arbeitsgruppe etablierten Gatingstrategie in Kombination mit einer durchflusszytometrischen Analyse der erhaltenen Zellen bestimmt (Grabrucker et al., 2010; Liepert et al., 2010). Um die bestmögliche Charakterisierung der T-Zell-Subtypen vornehmen zu können verglichen wir verschiedene T-Zell-Panels in einem Vorversuch. Dabei kamen wir zu dem Schluss, dass sich die von Sallusto beschriebenen T-Zellsubtypen Tnaive, Tcm, Tem und Teff (Sallusto et al., 1999) am besten mit den Oberflächenmarkern CD45RO, CCR7 und CD27 darstellen ließen. Auf diese Weise war es sogar möglich in einem 4-Kanal-Durchflusszytometer einen weiteren Oberflächenmarker dazu zu kombinieren. Mittels Durchflusszytometrie bestimmten wir die Zusammensetzung und Differenzierung von verschiedenen T-Zell-Subtypen in 12 AML Patienten im Vergleich zu 5 gesunden Probanden vor, während und nach Stimulation mit ‘DC’ oder mononukleären Zellen (‘MNC’) in einer 7 Tage währenden gemischten Lymphozyten-Reaktion (MLR). Dabei legten wir den Fokus auf die qualitative und quantitative Erfassung aktivierter T-Zellen, von T-Zellen in unterschiedlichen Differenzierungsstadien (Tnaive, Tcm, Tem und Teff) und von β-Integrin-exprimierenden T-Zellen. Zusätzlich verglichen wir stimulierte und nicht-stimulierte T-Zellen in ihrer Zusammensetzung und bestimmten deren antileukämische Funktionalität. Ziel dieser Arbeit war es Zusammenhänge der T-Zell-Profile mit der Funktionalität zu erkennen und prädiktive Marker herauszuarbeiten. Wir konnten zeigen, dass die T-Zellen von AML-Patienten im Vergleich zu gesunden Probanden vor Stimulation signifikant geringere Anteile an aktivierten T-Zellen, Tcm und β-Integrin+ T-Zellen und höhere Anteile an Tnaive sowie Teff aufwiesen. Nach 7 Tagen Stimulation mit ‘DC’ oder ‘MNC’ waren die T-Zell Profile charakterisiert durch einen signifikanten Anstieg von aktivierten T-Zellen mit Effektorfunktion. Auch nach Stimulation zeigten die AML-Patienten im Vergleich zu gesunden Probanden geringere Anteile an aktivierten T-Zellen, β-Integrin+ T-Zellen und Tcm dafür höhere Anteile an Teff. 64% der Fälle nach ‘DC’- Stimulation wiesen im Vergleich zu 40% der Fälle nach ‘MNC’-Stimulation antileukämische Zytotoxizität auf, was die Überlegenheit der ‘DC’ im Vergleich ‘MNC’ als Stimulatoren unterstreicht. Interessanterweise konnten wir dabei keinen signifikanten Unterschied der T-Zell-Profile zwischen ‘DC’- und ‘MNC’-stimulierten AML-Probanden feststellen. Die antileukämische Aktivität ging mit einem erhöhten Anteil an Tcm und Tnaive vor Stimulation als auch höheren Anteilen von Tcm, aktivierten T-Zellen und β-Integrin+ T-Zellen nach ‘DC’-Stimulation einher. Anhand unserer Daten war es erstmalig möglich, cut-off Werte für Aktivierungsmarker, Differenzierungsmarker und β-Integrin+ T-Zellen zu definieren, welche eine prädiktive Aussage über die antileukämische T-Zellantwort zulassen. Zusammenfassend bestätigt diese Arbeit die bedeutende und zentrale Rolle der T-Zellen in der Immunantwort bei leukämischen Erkrankungen. Durch den Vergleich verschiedener T-Zell-Profile konnten wir einen weiteren Beitrag in der Charakterisierung und Detektion verschiedener T-Zell-Subtypen erbringen. Wir konnten erneut zeigen, dass die spezifische antileukämische T-Zell-Antwort durch ‘DC’-Stimulation verbessert werden kann. Unsere Arbeit zeigt, dass AML Patienten mit hohen Anteilen an Tcm und Tnaive vor Stimulation besonders von einer ‘DC’-Stimulation profitierten. Verschiedene T-Zell-Subtypen konnten dabei als prädiktive Marker herausgearbeitet werden: Zellen von AML-Patienten mit hohen Anteilen an aktivierten T-Zellen, β-Integrin+ T-Zellen und Tcm nach ‘DC’-Stimulation zeigten eine erhöhte antileukämische Funktionalität, was diese T-Zell-Subtypen zu interessanten Ansatzpunkten einer antileukämischen Immuntherapie machen könnte.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: AML, Immunotherapie, Dentdritische Zellen leukämischen Ursprungs, T-Zell Differenzierung, T-Effektorzellen, T-Gedächtniszellen, beta-Integrine
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 16. Juni 2016
• 1. Bericht­erstatter:in: Schmetzer, Helga