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Sariisik, Ediz (2016): Investigation of the molecular and biophysical mechanisms of prostate cancer cell interactions with bone marrow-derived proteins and stem cells. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät
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Abstract

Prostate cancer is one of the most commonly diagnosed cancer in males. At the early stages of cancer surgical and hormonal therapies can be useful applied. The principal problem arising from prostate cancer is its predisposition to metastasize. After some point they form hormone independent cells, which can also be highly invasive. This tendency arises from specific molecular mechanisms and interactions that together lead to metastatic invasion into bone. In order to investigate in detail on this topic, typical components of bone tissue were presented as substrates for two species of prostate carcinoma cell lines (PC3 and LNCaP). This study was conducted with a variety of complementary techniques to investigate cell adhesion. While PC3 cells turned out to instantly interact strongly with bone tissue, LNCaP cells interacted weak and in contrast to PC3 even refused proliferating in this environment. By quantitative PCR and real time PCR, β1-integrins were identified as key players for the interaction between PC3 cells and bone tissue. Therefore, a prostate cell immobilized to the force sensor was mechanically brought in a controlled short contact to a collagen type–I (Col-I) substrate or to a monolayer of a bone marrow derived mesenchymal stem cell line (SCP1). Then the cell was retracted while recording interaction forces. An antibody specifically blocking β1-integrins corroborated the hypothesis that β1-integrins play a major role in this interaction, but also showed that due to a high integrin turnover rate antibody treatment might not be the ultimate strategy to interfere with prostate carcinoma metastasis into the bone marrow. Similar findings characterized a treatment of SCP1 monolayers with collagenase. Even though all measured parameters resulting from the force measurements revealed an almost identical behavior of the PC3 cells probed on both surfaces Col-I and SCP1, the treatment with collagenase suggested the possibility of PC3 cells involving different mechanisms for the interaction to Col-I or to SCP1 respectively. Long-term assays up to days for PC3 and LNCaP adhesion, proliferation and spreading in co-culture with SCP1 uncovered a very similar picture for the cell interactions as the force measurements. AFM, furthermore, provided a direct measure of the cell elasticity (Youngs’ modulus) and showed PC3 cells to be mechanically three times stiffer than LNCaP cells. Last during this project, a new evaluation method for force measurements was developed, that allowed to conclude on the connection of the adhesion molecules (integrins) to the intracellular cytoskeleton. From loading-rate vs. position probability density plots the anchorage of each individual detected unbinding event could be classified as rather membrane bound (tether) or cytoskeleton bound (jump). This method was clearly verified by treating the cells with Latrunculin-A a destructor of the actin filaments. For the interaction of prostate cell lines with bone tissue this evaluation method revealed not only that PC3 cells rather utilize cytoskeleton-supported receptors (filopodia) in contrast to LNCaP cells utilizing membrane bound receptors (tether) but also how blocking antibody treatment removed cytoskeleton-anchored receptors from participating in adhesion. Taken together, these findings might open a window for new applications to interfere with prostate carcinoma metastasis at the intracellular side of adhesion receptors by preventing cytoskeleton anchorage.

Abstract

Zu den am häufigsten in männlichen Patienten diagnostizierten Krebsarten gehört Prostatkrebs. Im Anfangsstadium können Resektion und Hormontherapie mit Erfolg eingesetzt werden. Aus seiner Neigung zur Metastasierung erwächst allerdings ein grundlegendes Problem, denn ab einem bestimmten Stadium werden die Zellen hormonresistent und können dann auch sehr invasiv werden. Diese Eigenschaft rührt von bestimmten molekularen Mechanismen und Wechselwirkungen, die in Kombination zu metastatischem Eindringen in das Knochengewebe führen. Um diese Zusammenhänge genauer zu verstehen wurden zwei Arten von Prostatakrebszellinien (PC3 und LNCap) typische Bestandteile des Knochengewebes präsentiert. In dieser Studie kamen unterschiedliche komplementäre Techniken zur Untersuchung der Zelladhäsion zum Einsatz. Dabei wechselwirkten PC3 Zellen sofort und sehr stark mit Knochengewebe, während die LNCaP Zellen schwach wechselwirkten und im Gegensatz zu PC3 Zellen sich in diesem Milieu nicht teilten. Mittels Quantitativer PCR und Echtzeit PCR wurden die β1-Integrine als die Hauptverantwortlichen für die Wechselwirkung zwischen PC3 Zellen und dem Knochengewebe identifiziert. Mittels Kraftmikroskopie (AFM) wurden die Kräfte zwischen den Prostata Zelllinien und dem Knochengewebe direkt gemessen. Hierfür wurde eine am Kraftsensor immobilisierte Prostata Krebszelle kontrolliert für einen kurzen Moment mechanisch in Kontakt mit einem Kollagen Typ-I (Col-I) Substrat oder mit einem Zellmonolayer einer mesenchymen Stammzellline aus dem Knochenmark (SCP1) gebracht. Die Wechselwirkungskräfte wurden aufgezeichnet, während die Zelle wieder vom Substrat getrennt wurde. Ein β1-Integrin blockender Antikörper bestätigte noch einmal die Hypothese, dass β1-Integrine für diese Wechselwirkung die wesentliche Rolle spielen. Aber es zeigte sich auch, dass eine Behandlung gegen Metastasierung von Prostata Karzinomen in das Knochenmark mit diesem Antikörper wegen des hohen Integrin Durchsatzes nicht die beste Strategie sein kann. Ähnliche Ergebnisse erzielte die Behandlung mit von SCP1 Monolayern mit Kollagenase. Obwohl alle Parameter aus den Kraftmessungen darauf hin deuteten, dass die PC3 Zellen sich nahezu identisch sowohl auf Col-I als auch auf SCP1 verhielten, legte der Einsatz von Kollagenase nahe, dass PC3 Zellen möglicherweise verschiedene Mechanismen für die Wechselwirkung mit Col-I oder SCP1 verwenden. Langzeit Testreihen von bis zu einigen Tagen zur Adhäsion, zur Zellteilung und zur Ausbreitung von PC3 und LNCaP Zellen in Mischkultur mit SCP1 Zellen zeichneten ein sehr ähnliches Bild der zellulären Wechselwirkungen wie die Kraftmessungen. Zusätzlich bietet das AFM die direkte Bestimmung der Zellelastizität (Youngs’ Modul) und es zeigte sich, dass PC3 Zellen mechanisch dreimal steifer sind als die LNCaP Zellen. Insbesondere wurde im Rahmen dieses Projektes eine neue Auswertungsmethode entwickelt, die Rückschlüsse über die Verankerung der Adhäsionsmolleküle (Integrine) mit dem intrazellulären Zytoskelett erlaubt. Durch Auftragung der Wahrscheinlichkeitsdichte der Ladungsrate gegen die Position konnte die Verankerung jedes einzelnen detektierten Bindungsereignisses in eher membrangebunden (Tether) oder Zytoskelettverbunden (Jump) unterteilt werden. Durch die Behandlung der Zellen mit dem Aktinfilament zersetzenden Latrunkulin-A konnte diese Methode eindeutig bestätigt werden. In Bezug auf die Wechselwirkung der Prostata Zelllinien mit Knochengewebe konnte diese Auswertungsmethodenicht nur zeigen, dass PC3 Zellen eher zytoskelettgebundene Rezeptoren (Filpodien) verwenden, während LNCaP Zellen eher membrangebundene Rezeptoren (Tether) verwenden, sondern sie zeigte auch, dass der Einsatz des blockenden Antikörpers zytoskelettgebundenene Rezeptoren daran hinderte an der Adhäsion mit zu wirken. Diese Ergebnisse könnten eine Tür zu neuen Anwendungen gegen Metastasierung von Prostata Krebs an der Intrazellulären Seite der Rezeptoren öffnen wobei deren Verankerung mit dem Zytoskelett unterbunden wird.