Molekulare Analyse der Funktion des TRPC6-Kanals in primären Podozyten der Maus

Demleitner, Jana (2016): Molekulare Analyse der Funktion des TRPC6-Kanals in primären Podozyten der Maus. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Bisher wurden sieben verschiedene TRPC-Kanäle (für „classical (oder canonical) transient receptor potential“) beschrieben, die in der Plasmamembran tierischer Zellen lokalisiert sind. Diese Kanäle gehören zu einer von sieben Familien der TRP-Ionenkanäle, deren Mitglieder an einer Vielzahl von physiologischen Funktionen im Körper beteiligt sind. Im Jahr 2005 konnten in Patienten, die an einer autosomal dominant vererbten Form der fokalen segmentalen Glomerulosklerose (FSGS) leiden, Mutationen der TRPC6-Kanäle identifiziert werden, die zu einer Überaktivität dieser Kanäle führen ( sog. “gain-of-function”-Mutationen). Etwas später (2006) wurden aber auch einige FSGS Patienten entdeckt, die keine „gain-of-function“-Mutationen im TRPC6 sondern funktionslose, sog. „loss of function“-Mutationen der Phospholipase Cɛ (PLCɛ) exprimierten. Diese Daten deuten auf eine funktionelle Interaktion zwischen TRPC6 und PLCɛ in Zellen der Niere hin, die bisher noch nicht näher untersucht worden ist. Beide Proteine könnten sich auch als Zielstrukturen für eine Pharmakotherapie der FSGS eignen. Die FSGS äußert sich durch eine Störung des glomerulären Filtrationsprozesses in der Niere, wodurch es unter anderem zu einer Proteinurie kommt. In vielen Fällen führt die FSGS terminal zur ESRD („end stage renal disease“), also zu einem akuten Nierenversagen. Glomeruli bilden die filtrierende Einheit der Niere, wobei der eigentliche Filter, welcher im Inneren des Glomerulus lokalisiert ist, aus Podozyten, Endothelzellen und der dazwischen befindlichen Basalmembran besteht. Da TRPC-Kanäle unter anderem in Podozyten exprimiert werden, liegt die Annahme nahe, dass diese Zellen durch den vermehrten Ca2+-Einstrom mutierter Kanäle bei der FSGS krankhaft verändert sein könnten. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit Podozyten aus Wildtyp (WT)-Mäusen sowie TRPC6 (TRPC6-/-)- und PLCε (PLCε-/-)-gendefizienten Tieren isoliert und umfangreich durch den Nachweis podozytenspezifischer Markerproteine charakterisiert. Zellfunktionen wie Proliferation, Aktinstressfaserbildung, RhoA- und TRPC6-Aktivität wurden vergleichend in den Zellen der verschiedenen Genotypen analysiert. Es zeigte sich, dass PLCε zwar mit TRPC6 in Zellen des Nierenkortex interagieren kann, aber PLCε-/--Podozyten funktionell in ihrer Angiotensin II-induzierten Aktinstressfiberbildung und GTPγS-induzierten TRPC6-Aktivierung nicht von Wildtyp-Podozyten unterschieden werden konnten, was auf eine redundante Funktion der PLCε-vermittelten TRPC6-Aktivierung hindeutet. Eine Aktivierung von TRPC6 durch PLCε wird wahrscheinlich durch die Stimulation der wesentlich stärker exprimierten anderen PLC-Isoform PLCβ1, zumindest in Podozyten, überdeckt. Eine Expression der klonierten murinen TRPC6-FSGS-Mutanten in primär isolierten Wildtyp- und TRPC6-defizienten Podozyten war für die Zellen lethal, wodurch die Pathogenität eines erhöhten TRPC6-induzierten Ca2+-Einstroms für diese Zellen und damit den gesamten Nierenglomerulus in FSGS-Patienten noch einmal nachgewiesen werden konnte. In Zukunft könnten deswegen spezifische TRPC6-Inhibitoren eine Therapieoption zur Linderung der Symptome bei FSGS-Patienten sein.

Abstract

Seven TRPC (for „classical (or canonical) transient receptor potential) channels which are located in the cell membrane were identified in recent years. These channels take part in a variety of physiological functions in the body. In several patients, suffering from an autosomal dominant form of focal segmental glomerulosklerosis (FSGS), mutations of TRPC6-channels were identified. These mutations are gain-of-function-mutations, leading to channel hyperactivity. Some FSGS patients however, express loss-of-function-mutations in Phospholipase Cɛ (PLCɛ) instead of gain-of-function-mutations of TRPC6. These data raise the intriguing possibility that both proteins interact and might work in the same signalling pathway as well are important targets for pharmacological intervention in patients with FSGS. Moreover, while TRPC6 activation by PLCβ and PLCγ isozymes was extensively studied, the role of PLCε in TRPC6 activation remains elusive. The phenotype of FSGS is a perturbation of the glomerular filtration process in the kidney, leading to proteinuria. In most cases FSGS leads to end stage renal disease (ESRD) with acute renal failure. Glomeruli are the filtrating unit oft the kidney. The filter, inside of the glomeruli, is composed out of podocytes, endothelial cells and the intermediary basal membrane. Because TRPC6 is expressed in podocytes, excess Ca2+-influx through mutated TRPC6 channels in podocytes may be responsible for the FSGS phenotype. Therefore, podocytes from wild-type (WT), TRPC6 (TRPC6-/-)- and PLCε (PLCε-/-)-deficient podocytes were isolated and extensively characterized by identification of podocyte-specific marker proteins. Cell functions like proliferation, formation of actin stress fibers, RhoA- and TRPC6-activity were analyzed in cells of all three genotypes. Although TRPC6 was co-immunoprecipitated with PLCε in murine kidney cortex, PLCε-/--podocytes were undistinguishable from WT-podocytes in their DNA-synthesis rate, angiotensin II-induced formation of actin stress fibers as well as their GTPγS-induced TRPC6 activation, pointing to a redundant role of PLCε-mediated TRPC6 activation. Thus, PLC activation of TRPC6 may be masked by much higher expression levels of another PLC-isoform PLCβ1 at least in podocytes. Expression of cloned TRPC6-FSGS-mutants in primary isolated wild-type and TRPC6-deficient podocytes was lethal emphasizing the pathogenicity of an increased TRPC6-induced Ca2+-influx for these cells and kidney glomeruli of FSGS-patients. Along these line specific TRPC6-inhibitors may serve as therapeutic option to decrease symptoms in FSGS patients in the future.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: TRPC6,PLC,Niere,Podozyten,Kanäle
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 8. Februar 2016
• 1. Bericht­erstatter:in: Dietrich, Alexander