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Jaitner, Stefanie (2016): The role of the stem cell marker OLFACTOMEDIN-4 and the microRNA generator DICER1 in colorectal carcinogenesis. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät
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Abstract

The intestine is a pivotal organ which is divided into two anatomical parts: the small intestine and the large intestine (colon and rectum). Both parts are made up of single layered epithelium. This epithelium is composed of villi (protrusions) – found only in the small intestine - and crypts (invaginations) leading to an increase of the surface of the intestinal lumen whereby the uptake of nutrients and water is improved. Every five days, the intestinal epithelium is renewed whereby both, crypts and eventually villi, are filled up with new cells. The homeostasis of the crypts/villi relies on adult stem cells (SCs), especially crypt base columnar (CBC) cells, which are located at the base of the crypts. These are regulated by an active Wnt signaling pathway. A deregulation of the Wnt signaling pathway leads to cancer formation found in humans almost exclusively in the colon and rectum. Colorectal cancer (CRC) is worldwide the third most common cause for cancer related deaths. In the majority of CRC, origin and progress are caused by mutations in the adenomatous polyposis coli (APC) gene which encodes an essential component of the β-catenin destruction complex that is the central element of the Wnt signaling pathway. As a consequence of these mutations, the executor of the Wnt signaling pathway, β-catenin, which is in this context a transcription factor, cannot be downregulated any more. As a consequence target genes of β-catenin are expressed in an unregulated manner. These target genes regulate features of stem cell biology which confer cancer stemness, metastasis, EMT (epithelial-mesenchymal transition), chemoresistance and other characteristics to colorectal tumor cells. Interestingly, APC mutations have only an effect when they occur in the adult stem cells. Thus, the descendend tumor cells show characteristics of these cells and have been termed cancer stem cells (CSCs). Like adult stem cells in the normal crypt CSCs are the origin of cancer and are characterized by an activated - here deregulated - Wnt signaling pathway and thus, by the aforementioned features. Clinically, cancer death is caused in most cases by metastasis which is treated by chemotherapy from which most if not all CRCs escape by the development of chemoresistance which is an intrinsic feature of the CSCs. Therefore, CSC specific targeted therapies might be a promising therapeutic tool for a successful treatment of CRCs. One possibility is the interference of CSC sustaining molecules as these molecules are involved in the induction and maintenance of CSCs. Here, a promising molecule is olfactomedin-4 (OLFM4) which was discussed to be a CSC marker. But the role of OLFM4 as a CSC marker and important factor for tumorigenesis has been controversially described. Therefore, I investigated in the first part of my thesis the role of OLFM4 in CRC cells. I demonstrate that OLFM4 was expressed only in two out of 14 CRC cell lines. The assumption that OLFM4 was only expressed in cells with characteristics of CSCs and thus, was not detected in the cell lines as they possess only a small proportion of CSCs, was not confirmed. I found that CSCs showed a reduced OLFM4 expression and thus, OLFM4 was not coexpressed with other SC markers. These results indicate that OLFM4 is not a marker of CSCs in CRC. In order to analyze the functional role of OLFM4 in CRC cells, I overexpressed OLFM4 lentivirally. However, the overexpression of OLFM4 and thus, high OLFM4 protein levels did not influence the expression of CSC, EMT or differentiation marker. Likewise, OLFM4 did not play a functional role for proliferation, stemness and metastatic features. Therefore, this study demonstrates that OLFM4 is not a CSC marker and has no functional role for the driving activity in the process of colorectal carcinogenesis. Additionally, I evaluated in the second part of my thesis the role of the microRNAome (miRNAome) in colorectal carcinogenesis, the influence on CSC features and whether the miRNAome might be a tool for specific CSC targeted therapies. microRNAs (miRNAs) are generally downregulated in tumors whereby the miRNA loss promotes tumorigenesis. As the majority of the CRC cases are driven by an APC mutation in the SC compartment, I used for my investigations a mouse model with a conditional Apc knockout in CBC cells which develops efficiently intestinal adenomas. This mouse model was crossed with another mouse model harboring a conditional knockout of the essential miRNA generator Dicer1 to investigate the role of a loss of the miRNAome in murine Wnt driven intestinal tumors. In this part of my study I demonstrated that hetero- and homozygous deletion of Dicer1 in CBC cells, in combination with an Apc knockout, enhances significantly the number of adenomas. Moreover, deletion of Dicer1 resulted in smaller adenomas caused by reduced proliferation. Further analysis of DICER1 deletion in human CRC cell lines revealed that loss of DICER1 and thus, miRNAs led likewise to a decreased proliferation. Additionally, I showed that loss of miRNAs increased the expression/protein levels of CSC markers and CSC features indicating that loss of DICER1 promotes tumorigenesis. Moreover, I translated these mouse model/cell culture results into human colonic normal and tumor tissue as well as CRC. In a collection of different tissues (normal tissue, adenomas and cancers of stages I to IV), increased DICER1 levels were seen from normal tissue to adenomas followed by decreased levels during carcinoma progression. Increased levels of DICER1 were also found in the murine Wnt driven adenomas. In support with this I provided finally evidence that DICER1 expression is regulated by the Wnt signaling pathway thus already early in the beginning of the colorectal tumorigenesis. Thus, this data showed that DICER1 is a tumor suppressor in intestinal cancer and the loss of DICER1 and hence, of the miRNAome, influences CSC marker expression and marker protein levels as well as proliferation and CSC features. Therefore, the miRNAome might possibly become a therapeutic target for CSC targeted therapy.

Abstract

Der Darm ist ein lebenswichtiges Organ, das in zwei anatomische Teile geteilt ist: den Dünndarm und den Dickdarm (Kolon und Rektum), die beide aus einem einschichtigen Epithel bestehen. Dieses Epithel besteht aus Villi (Ausstülpungen) - nur im Dünndarm vorhanden - und Krypten (Einstülpungen) und führt zu einer Vergrößerung der Oberfläche des intestinalen Lumens, wodurch die Aufnahme von Nährstoffen und Wasser verbessert wird. Alle fünf Tage wird das intestinale Epithel erneuert, wodurch Krypten und schließlich auch Villi mit neuen Zellen aufgefüllt werden. Die Homöostase der Krypten/Villi beruht auf adulten Stammzellen (SZ), insbesondere „crypt base columnar“ (CBC)-Zellen, die an der Kryptenbasis angesiedelt sind und durch einen aktiven Wnt Signalweg reguliert werden. Eine Deregulierung des Wnt-Signalweges führt zur Bildung von Krebs, welcher bei Menschen hauptsächlich im Kolon und Rektum auftritt. Unter den Krebsarten stellt das kolorektale Karzinom (KRK) weltweit die dritthäufigste Ursache für Krebstod dar. Meist sind sowohl das Auftreten als auch die Progression des KRK durch Mutationen im Adenomatous polyposis coli (APC)-Gen verursacht, das eine essentielle Komponente des β-catenin-Abbaukomplexes und daher eine zentrale Komponente des Wnt-Signalweges ist. Als Konsequenz kann der Transkriptionsfaktor des Wnt-Signalweges, β-catenin, nicht mehr herunterreguliert werden, wodurch β-catenin-Zielgene unreguliert exprimiert werden. Diese Zielgene regulieren wichtige Eigenschaften von Krebszellen wie Krebs- Stammzelligkeit, Metastasierung, EMT (Epitheliale-mesenchymale Transition), Chemoresistenz sowie weitere Eigenschaften. Interessanter Weise haben APC-Mutationen nur einen Einfluss, wenn sie in adulten SZ auftreten. Die von diesen SZ abstammenden Tumorzellen weisen Charakteristika dieser Zellen auf und werden Krebsstammzellen (KSZ) genannt. KSZ sind verantwortlich für die Krebsbildung, charakterisiert durch einen aktivierten Wnt-Signalweg und daher durch die zuvor genannten Eigenschaften. Die häufigste Ursache für den Krebstod sind Metastasen. Metastasen werden mit Chemotherapie behandelt, wobei sich in den meisten Fällen KSZ dieser Behandlung durch die Entwicklung von Chemoresistenz entziehen können. Chemoresistenz ist eine intrinsische Eigenschaft von KSZ. Daher könnten Therapien, welche spezifisch KSZ angreifen, einen vielversprechenden Therapieansatzpunkt darstellen. Eine Möglichkeit dafür ist die Beeinträchtigung stammzellunterstützender Moleküle, da diese in die Induktion und Aufrechterhaltung von KSZ involviert sind. Ein vielversprechendes Molekül ist olfactomedin-4 (OLFM4), das bereits als SZ-Marker diskutiert wurde. Aber die Rolle von OLFM4 als SZ-Marker und als wichtiger Faktor für die Tumorigenese wurde bisher kontrovers beschrieben. Daher habe ich im ersten Teil meiner Doktorarbeit die Rolle von OLFM4 in KRK-Zellen untersucht. Ich zeigte, dass OLFM4 nur in zwei von 14 Zelllinien exprimiert wurde. Die Annahme, dass OLFM4 nur in Zellen mit KSZ-Eigenschaften exprimiert wird und daher in Zelllinien nicht detektiert wird, da diese nur einen kleinen Anteil an KSZ besitzen, wurde nicht bestätigt.Des Weiteren habe ich herausgefunden, dass KSZ eine reduzierte OLFM4-Expression zeigen, wodurch OLFM4 nicht zusammen mit anderen SZ-Markern exprimiert wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass OLFM4 kein Marker von KSZ im KRK ist. Um die funktionelle Rolle von OLFM4 in KRK-Zellen zu untersuchen, habe ich OLFM4 lentiviral überexprimiert. Jedoch beeinflusste eine Überexpression von OLFM4 und somit hohe OLFM4-Proteinlevel nicht die Expression von KSZ-, EMT- und Differenzierungsmarkern. Ebenso spielte OLFM4 keine funktionelle Rolle in der Proliferation, KSZ- sowie Metastasierungs-Eigenschaften. Daher zeigt diese Studie, dass OLFM4 kein KSZ-Marker ist und keine funktionelle Rolle als treibende Kraft im kolorektalen Karzinogeneseprozess hat. Im zweiten Teil meiner Doktorarbeit habe ich die Rolle des miRNAoms in der kolorektalen Karzinogenese und seinen Einfluss auf SZ-Eigenschaften untersucht mit dem Ziel, ob das miRNAom einen Ansatzpunkt für eine spezifische KSZ-Therapie darstellen könnte. miRNAs sind in Tumoren generell herunterreguliert, was darauf schließen lässt, dass ein miRNA-Verlust die Tumorigenese begünstigt. Da die Mehrheit der KRK-Fälle durch eine APC-Mutation im SZ-Kompartment angetrieben wird, habe ich für meine Untersuchungen ein Mausmodell mit einem konditionalen Apc-Knockout in den CBC-Zellen verwendet, welches effizient intestinale Adenome entwickelt. Dieses Mausmodell wurde mit einem anderen Mausmodell mit einem konditionalen Knockout des miRNA-Generators Dicer1 gekreuzt. Damit konnte die Rolle eines miRNAom-Verlustes in murinen intestialen Tumoren, welche vom Wnt-Signalweg angetrieben werden, untersucht werden. In diesem Teil meiner Studie zeige ich, dass eine hetero- und homozygote Deletion von Dicer1 in CBC-Zellen, in Kombination mit einem Apc-Knockout, signifikant die Adenomzahl erhöhte. Außerdem resultierte eine Dicer1-Deletion in einer kleineren Adenomgröße, was durch eine verringerte Proliferation verursacht wurde. Eine weiterführende Analyse der DICER1-Deletion in humanen KRK-Zelllinien zeigte, dass ein Verlust von DICER1 und folglich miRNAs ebenso zu einer verringerten Proliferation führte. Außerdem erhöhte ein miRNA-Verlust die Expression/Proteinlevel von KSZ-Markern und KSZ-Eigenschaften. Diese Ergebnisse zeigen, dass ein Verlust von DICER1 die Tumorigenese fördert. Um diese Zellkultur/Mausmodell-Ergebnisse auf den Menschen zu übertragen, habe ich humanes Normal-, Adenom- und Krebsgewebe (Stadium I bis IV) von KRK-Patienten analysiert. Dabei nahm das DICER1-Proteinlevel vom Normalgewebe zu den Adenomen zu. Während der Karzinomprogression nahm das DICER1-Proteinlevel jedoch von den Adenomen bis hin zum Karzinom ab. Einen Anstieg des DICER1-Proteinlevels habe ich auch in murinen Wnt-getriebenen Adenomen gefunden. Daher erbringe ich schlussendlich einen Nachweis, dass die DICER1-Expression vom Wnt-Signalweg und daher früh in der Tumorigenese reguliert wird. Folglich zeigen diese Daten, dass DICER1 im Darmkrebs ein Tumorsuppressor ist und ein Verlust von DICER1 und somit des miRNAoms KSZ-Markerexpression und Markerproteinlevel sowie Proliferation und KSZ-Eigenschaften beeinflusst. Daher könnte das miRNAom möglicherweise einen Ansatzpunkt für Therapien, welche spezifisch KSZ angreifen, darstellen.