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Uhl, Franziska (2015): Determination of lung regeneration using an ex vivo tissue slice model. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät
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Abstract

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is the fourth leading cause of death worldwide. At the moment no curative treatment is available. Thus far, lung transplantation is the only option however donor organ shortage limits its general clinical application. New therapies are desperately needed. Here, 3D ex vivo lung tissue cultures (3D-LTC) from diseased murine and human lungs were applied to study repair and remodelling in high spatio-temporal resolution. In a first step, the method of 3D-LTC generation and cultivation was optimized and improved. Cell viability and proliferation was maintained until day seven. Murine and human lung samples were examined by histology, immunofluorescence, spatio-temporal confocal live-cell-imaging, as well as gene and protein expression analyses to fully characterize the suitability of the model for signal pathway modulation. Previous reports demonstrated that Wnt/beta-catenin signal activation led to attenuation of experimental emphysema in mice [Kneidinger, et.al., 2011]. TGF-beta is another pathway involved in COPD and a lack of TGF-beta seems to be related to the emphysematous changes [Budd, et.al., 2012]. To get insight into disease underlying mechanisms the COPD-relevant signalling pathways Wnt/beta-catenin and TGF-beta were activated in 3D-LTC from COPD patients and emphysematous animals. It was demonstrated that Wnt/beta-catenin signal activation initiated epithelial repair in 3D-LTC. Moreover, Wnt/beta-catenin pathway activation and alveolar epithelial type II cell activation significantly correlated with individual disease stage suggesting that 3D-LTC from patients are suitable for individual drug validation and therapy prediction. TGF-beta signalling activation led to the production of extracellular matrix components and induced expression of transcription factors and genes involved in epithelial-to-mesenchymal transition. In conclusion, the model of 3D-LTC established in this thesis allows quantification and spatio-temporal visualization of regenerative processes in the lung. It is suitable to validate and give further mechanistical insight of Wnt/beta-catenin and TGF-beta induced lung repair and remodelling, as well as treatment response prediction to individualized therapy. Thus, the 3D-LTC model presents a superior system for preclinical drug validation.

Abstract

Die Chronisch obstruktive pulmonäre Erkrankung (COPD) ist die vierthäufigste Todesursache weltweit. Derzeit gibt es keine kurativen Therapieansätze und eine Lungentransplantation stellt die einzige lebensverlängernde Behandlungsalternative dar. Allerdings führt der Mangel an Spenderorganen dazu, dass die Lungentransplantation nicht für alle Patienten angewendet werden kann. Neue Therapieansätze werden daher dringend benötigt. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Methode zur 3D ex vivo Kultivierung von Lungengewebe (3D-LTC) murinen und humanen Ursprungs angewendet, um die Regeneration und Wiederherstellung von Lungengewebe in hoher örtlicher und zeitlicher Auflösung zu untersuchen. In einem ersten Schritt wurde die Herstellung und Kultivierung der 3D-LTC im Vergleich zu bisherigen Methoden verbessert. Zell-Vitalität und –Proliferation konnten bis Tag sieben erhalten werden. Murine sowie humane Proben wurden mittels histologischer und Immunfluoreszenz-Färbungen, orts- und zeit-aufgelöster konfokaler live-cell-Mikroskopie als auch Gen- und Protein-Expressionsanalysen untersucht, um das Model der 3D-LTC hinsichtlich seiner Eignung zur Untersuchung von Signalwegsmodulationen zu charakterisieren. Wie bereits gezeigt, führte die Aktivierung des Wnt/beta-Catenin-Signalweges zur Verminderung des Elastase-induzierten Emphysem im Mausmodel [Kneidinger, et.al., 2011]. TGF-beta ist ein weitere Signalweg der eine Rolle in der COPD spielt und ein TGF-beta-Mangel kann mit der Entwicklung des Emphysems in Verbindung gebracht werden [Budd, et.al., 2012]. Um weitere Erkenntnis über die mechanistischen Ursachen zu erhalten, wurden die COPD-relevanten Signalwege Wnt/beta-Catenin und TGF-beta in 3D-LTC von COPD Patienten und emphysematösen Mäusen aktiviert. Es konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung des Wnt/beta-Catenin Signalweges epitheliale Reparatur¬mechanismen in den 3D-LTC induziert. Weiterhin korrelierten die Aktivierung des Wnt/beta-Catenin-Signalweges sowie die Aktivierung von alveolären Typ-II-Epithelzellen mit dem Krankheitsschweregrad des Patienten. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass 3D-LTC von Patienten für die Medikamentenevaluierung hinsichtlich personalisierter Medizin nützlich sein können. Des weiteren war eine Aktivierung des TGF-beta-Signalweges in 3D-LTC möglich. TGF-beta führte zur Herstellung von Komponenten der extra-zellulären Matrix sowie der Expression von Transkriptionsfaktoren und Genen, die auf eine epitheliale-zu-mesenchymale Transition hinweisen. Es kann daher geschlussfolgert werden, dass das in dieser Arbeit etablierte Model der 3D-LTC die Quantifizierung sowie ort- und zeit-aufgelöste Visualisierung sowohl regenerativer als auch remodulierender Prozesse in der Lunge möglich macht. Die individuelle Reaktion auf eine bestimmte medikamentöse Behandlung kann damit besser prognostiziert werden. Dadurch stellt das in dieser Arbeit etablierte Model der 3D-LTC ein ausgezeichnetes System zur pre-klinischen Medikamententestung dar.