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Bartel, Sabine (2015): microRNA-based identification of pulmonary signaling pathways in experimental asthma: the role of the cAMP responsive element binding protein (Creb1). Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät
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Abstract

Asthma is characterized by chronic airway inflammation; mucus hypersecretion and episodes of airway obstruction. It is the most common chronic disease in children and its incidence and prevalence have been markedly increasing over the last few decades. While the pathophysiology has been intensively studied, the underlying causes for asthma development remain largely unknown. Hence there is an unmet, clinical need to identify novel, so far non-characterized pathways, relevant for this disease, to establish new therapies or preventive approaches. We used miRNAs to do so as they are critical regulators of key molecules within signalling pathways. Our group previously identified a pulmonary increase of miR-17 and -144 in ovalbumin-induced allergic airway inflammation in mice and they were shown to target the transcription factor cAMP-responsive element binding protein 1 (Creb1). In this work, we found and validated additional binding sites for the two miRNAs and the newly included miR-21 in the 3’UTR of Creb1 co-activators CRTC1, -2 and -3. Creb1 and the three Crtcs were further shown to be down-regulated in two models of murine experimental asthma (ovalbumin and house dust mite). We postulated that a joint down-regulation of Creb plus its co-activators by the miRNAs might have detrimental, additive effects on the expression of target genes. In this respect, we identified the putative Creb1 target gene Sec14-like 3 (Sec14l3) which was down-regulated in both models for murine experimental asthma and its loss seemed to be associated with goblet cell metaplasia. Furthermore, we found that IL-13 treatment of primary normal human epithelial (NHBE) cells led to a decrease of CREB1/CRTCs and SEC14L3, while the latter correlated with forkheadbox protein J1 (FOXJ1), a marker for ciliated cells. miR-17, -144 and -21 were actively secreted into exosomes by the primary NHBE cells upon IL-13 stimuli, which could be uptaken by a bronchial epithelial cell line and a T cell line . We could also detect miRNA-containing exosomes in nasal washes from children with allergic asthma and broncho-alveolar lavage fluid of mice with OVA-induced allergic airway inflammation. In nasal epithelial cells of children with allergic asthma, the three miRNAs were highly increased compared to healthy controls, while SEC14l3 expression was reduced. In conclusion, this work identified a novel molecular axis (miRNA-Creb/Crtc/Sec14l3) relevant for murine and paediatric asthma and gives first hints that miR-17, -144 and -21 in exosomes might be able to perpetuate the asthmatic response between different cell types.

Abstract

Asthma ist die häufigste chronische Erkrankung bei Kindern und sie ist in ihrer Prävalenz und Inzidenz über die letzten Jahrzehnte stark angestiegen. Das Krankheitsbild an sich ist bis zum heutigen Zeitpunkt intensiv erforscht worden, wobei über die Entstehung von Asthma im Kindesalter noch wenig bekannt ist. Aus diesem Grund ist es wichtig, neue Signalwege zu identifizieren, die für die Asthmaentstehung relevant sind, auch um daraus eventuell neue therapeutische Ansätze oder präventive Strategien zu entwickeln. Dafür haben wir microRNAs (miRNA) verwendet, die oft mehrere Schlüsselfaktoren in denselben Signalwegen regulieren. In vorrangegangener Arbeit hat unsere Gruppe gefunden, dass pulmonale miR-17 und miR-144 bei Ovalbumin (OVA) -induziertem experimentellen Asthma in Mäusen erhöht sind, und, dass sie den Transkriptionsfaktor „cAMP-responsive element binding protein“ (Creb) regulieren können. In dieser Arbeit haben wir nun weitere Bindestellen für miR-17 und -144, sowie auch für die neu miteinbezogene miR-21, in den 3’UTRs von Creb1 Co-Aktivatoren (Crtc1-3) gefunden und in in vitro Experimenten validiert. Sowohl Creb1 als auch die drei Crtcs waren in Lungengewebe von Tieren mit experimentell induziertem Asthma durch OVA und Hausstaubmilben (HDM) verringert. Weiterhin haben wir die Expression eines möglichen Creb1 Zielgenes, Sec14-like 3 (Sec14l3), untersucht, welches ebenfalls in beiden Asthma Mausmodellen im Lungengewebe herunterreguliert war. Außerdem war der Verlust an Sec14l3 Protein in der Lunge mit der Hyperplasie von Mucus-produzierenden Becherzellen assoziiert. In der Kultur von primären humanen Bronchialzellen (NHBE) führte eine Behandlung mit IL-13 zu einer transienten Herunterregulierung von Creb1, den Crtcs und Sec14l3. miR-17, -144 und -21 wurden nach IL-13 von diesen Primärzellen vermehrt in Exosomen sekretiert und diese konnten von Bronchialepithelzellen, und T Zellen aufgenommen werden. Die drei miRNAs konnten auch in Exosomen aus Nasenspülungen von Kindern mit allergischem Asthma und in bronchoalveolarer Lavage in Mäusen mit experimentellem Asthma gefunden werden. In nasalen Epithelzellen von Kindern mit allergischem Asthma waren miR-17, -144 und -21 stark erhöht und das Zielgen SEC14L3 herunter reguliert. Alles in Allem, haben wir in dieser Arbeit eine neue molekulare Achse (miRNA-Creb/Crtc-Sec14l3) gefunden, die relevant sein könnte für die Asthmaentstehung bei der Maus aber auch bei Kindern. Die Sekretion der miRNAs in Exosomen könnte die Reaktion der Zellen auf asthmatische Stimuli auf mehrere, verschiedene Zelltypen verteilen.