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Voss, Matthias (2014): Signal peptide peptidase-like 3 (SPPL3) is a type II membrane protein-selective sheddase that regulates cellular N-glycosylation. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät
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Abstract

Intramembrane proteolysis - hydrolysis of membrane proteins within or close to their membrane-spanning regions - is a crucial cellular process that is conserved throughout all kingdoms of life. It is executed by distinct classes of polytopic membrane proteins, the intramembrane-cleaving proteases, that provide a hydrophilic, proteinaceous environment accommodating membrane protein substrates as well as water molecules within the hydrophobic membrane interior and catalyse peptide bond hydrolysis. In particular, intramembrane-cleaving aspartyl proteases have received attention as the presenilins, the catalytic subunits of the γ-secretase complex, were identified as key players in Alzheimer's disease pathophysiology. In addition to presenilins, mammalian genomes harbour presenilin homologues which include signal peptide peptidase (SPP) and SPP-like (SPPL) proteases. Among these, the Golgi-resident protease SPPL3 stands out as it is highly conserved among metazoa and SPPL3 orthologues are also found in plants. However, due to the lack of known substrates, SPPL3 has thus far hardly been characterised. Hence, the purpose of this study was to identify its substrates and elucidate its physiological function(s). In the first part of this study, the foamy virus envelope glycoprotein (FVenv) was identified as the first substrate of SPPL3. This allowed to study SPPL3's proteolytic activity in detail, with a focus on its substrate selectivity and sensitivity towards previously characterised inhibitors of intramembrane-cleaving aspartyl proteases. Importantly, this study revealed in addition that two other intramembrane-cleaving proteases, SPPL2a and SPPL2b, also endoproteolyse FVenv. SPPL2b in particular had been studied in detail before and therefore SPPL3- and SPPL2b- mediated endoproteolysis of FVenv were examined in parallel to directly compare these phylogenetically related intramembrane-cleaving proteases. This uncovered an unexpected idiosyncrasy of SPPL3 that clearly sets SPPL3 apart from other intramembrane-cleaving aspartyl proteases: SPPL3 endoproteolysed full-length FVenv and did not require the substrate's prior tailoring by another proteolytic activity - an otherwise common phenomenon among intramembrane-cleaving aspartyl proteases. In the second part, the physiological function of SPPL3 was investigated. Alterations in the cellular levels of proteolytically active SPPL3 turned out to impact the composition of N-glycans attached to endogenous cellular glycoproteins. SPPL3 over-expression was accompanied by a decrease in glycoprotein molecular weight, i.e. a hypoglycosylation phenotype, while loss of SPPL3 expression in cell culture models but also in vivo resulted in a hyperglycosylation phenotype. This led to the identification of Golgi glycan-modifying enzymes such as GnT-V and β3GnT1 as novel physiological substrates of SPPL3. Loss or reduction of SPPL3 expression, for instance, led to a marked intracellular accumulation of these enzymes, explaining the more extensive N-glycan elaboration and the hyperglycosylation phenotype observed under these conditions. At the same time secretion of these enzymes was reduced under these conditions. Together with additional observations such as the mapping of the SPPL3 cleavage site to the membrane-spanning region of GnT-V, this study demonstrates that SPPL3-mediated intramembrane proteolysis of such glycan-modifying enzymes liberates their active site-harbouring ectodomains. Acting in this manner, SPPL3 controls the intracellular pool of active glycan-modifying enzymes. Importantly, the finding that SPPL3 proteolytically cleaves full-length glycan-modifying enzymes and sheds their ectodomains is well in line with the observations made for FVenv and suggested that SPPL3 acts functionally equivalent to classical sheddases or rhomboid proteases but much unlike all other characterised mammalian intramembrane-cleaving aspartyl proteases. To examine whether these observations hold also true on a global cellular scale, a proteomic approach was undertaken in the third part of the study to define the SPPL3 degradome of HEK293 cells in conditions of SPPL3 over-expression. On the one hand, this led to the identification of numerous novel, mostly Golgi-resident candidate SPPL3 substrates and, considering the physiological implications, suggests that SPPL3 is very intricately linked to Golgi function. On the other hand, this approach supports the initial hypothesis that SPPL3 acts as a cellular type II membrane protein-selective sheddase. Taken together, this study provides the first in-depth characterisation of the intramembrane protease SPPL3 and reveals the cellular function of SPPL3. SPPL3 displays considerable and marked differences to other intramembrane-cleaving aspartyl proteases and emerges as a fundamental cellular sheddase that exhibits strong selectivity for type II-oriented, Golgi-resident membrane proteins. Products of SPPL3-mediated endoproteolysis of these Golgi factors are secreted and/or may be subject to intracellular degradation which compromises their catalytic activity. Thus, SPPL3 indirectly controls protein glycosylation in the Golgi apparatus.

Abstract

Intramembranproteolyse, die hydrolytische Spaltung von Membranproteinen innerhalb ihrer Transmembrandomänen, ist ein wichtiger zellulärer Prozess, der in allen Reichen der Lebewesen konserviert ist. Die Intramembranproteolyse wird von unterschiedlichen Klassen von polytopen Membranproteinen, den Intramembranproteasen, ausgeführt, die eine hydrophile Proteinumgebung innerhalb des hydrophoben Bereichs der Membran bilden. In dieser Umgebung finden sowohl Membranproteinsubstrate als auch Wassermoleküle Platz und Hydrolyse der Peptidbindung wird durch die Intramembranproteasen katalysiert. Vor allem die Aspartylintramembranproteasen haben sehr viel Aufmerksamkeit auf sich gezogen, da die Preseniline, die katalytischen Untereinheiten des γ-Sekretasekomplexes, als Schlüsselenzyme in der Pathophysiologie der Alzheimer-Erkrankung identifiziert wurden. Neben den Presenilinen finden sich in Säugetiergenomen auch Presenilinhomologe, welche sowohl die Signalpeptidpeptidase (SPP) als auch SPP-ähnliche (SPP-like, SPPL) Proteasen umfassen. Aus diesen sticht die im Golgi lokalisierte Protease SPPL3 heraus, da sie in vielzelligen Tieren hochkonserviert ist und sich SPPL3-Orthologe auch in Pflanzen finden. Gleichzeitig ist SPPL3 jedoch, vor allem aufgrund der Tatsache, dass keine Substrate beschrieben wurden, bisher kaum charakterisiert. Daher war es das Ziel dieser Arbeit Substrate von SPPL3 zu identifizieren und seine physiologische Funktion(-en) aufzuklären. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde ein erstes SPPL3-Substrat, das foamy-virale Hüllglykoprotein (FVenv), identifiziert. Dies erlaubte die proteolytische Aktivität von SPPL3 und insbesondere seine Substratselektivität sowie seine Sensitivität gegenüber Inhibitoren von Aspartylintramem- branproteasen im Detail zu untersuchen. Es konnte ebenfalls festgestellt werden, dass zwei weitere Intramembranproteasen, SPPL2a und SPPL2b, FVenv ebenfalls endoproteolytisch spalten. Vor allem SPPL2b war bereits zuvor im Detail untersucht worden und daher konnte die SPPL3- beziehungsweise SPPL2b-vermittelte Endoproteolyse von FVenv verglichen werden. Dies offenbarte eine unerwartete Eigenheit von SPPL3, welche SPPL3 deutlich von anderen Intramembranproteasen, vor allem den anderen Aspartylintramembraneproteasen, unterschiedet: SPPL3 spaltete das FVenv-Holoprotein und bedarf keinem vorherigen Zuschneiden des Substrates durch eine andere proteolytische Aktivität - ein sonst sehr verbreitetes Phänomen bei Intramembranproteasen. Im zweiten Teil sollte die physiologischen Funktion von SPPL3 untersucht werden. Dabei zeigte sich, dass Änderungen in der zellulären SPPL3-Aktivität große Auswirkungen auf die Zusammensetzung der N-Glykane auf endogenen zellulären Glykoproteinen haben. SPPL3- Überexpression ging mit einer Reduktion des Molekulargewichts untersuchter Glykoproteine, einem so genannten Hypoglykosylierungsphänotyp, einher, während der Verlust der SPPL3- Expression im Zellkulturmodell aber auch in vivo in einem Hyperglykosylierungsphänotyp resultierte. Dies führte zur Identifizierung von glykanmodifizierenden Enzymen im Golgi wie beispielsweise GnT-V und β3GnT1 als physiologische SPPL3-Substrate. Verlust oder Reduktion der SPPL3-Expression führte zu einer starken intrazellulären Akkumulation dieser Substrate, was die unter diesen Bedingungen beobachtete umfassendere N-Glykan- ausarbeitung sowie den Hyperglykosylierungsphänotyp erklärte. Gleichzeitig wurde die Sekretion dieser Enzyme unter diesen Bedingungen stark beeinträchtigt. Zusammen mit weiteren Beobachtungen wie der Bestimmung der SPPL3-Schnittstelle im Bereich der Transmembrandomäne von GnT-V zeigte diese Studie, dass die von SPPL3 vermittelte Intramembranproteolyse solcher glykan-modifizierenden Enzyme deren Ektodomainen freisetzt und SPPL3 folglich auf diese Weise das intrazelluläre Reservoir aktiver glykan-modifizierender Enzyme kontrolliert. Hervorzuheben ist dabei, dass diese Erkenntnis in guter Übereinstimmung mit den für FVenv gemachten Beobachtungen steht. Dies legt wiederum nahe, dass SPPL3 in funktioneller Hinsicht mit einer klassischen Sheddase oder einer Rhomboidprotease gleichgestellt ist, sich jedoch von allen anderen charakterisierten Aspartylintramembranproteasen in Säugetieren unterscheidet. Um herauszufinden, ob diese Beobachtungen auch auf globaler zellulärer Ebene Bestätigung finden, wurde eine Proteomanalyse im dritten Teil dieser Arbeit durchgeführt, um das SPPL3-Degradom in HEK293-Zellen unter Überexpressionsbedingungen zu definieren. Dies führte einerseits zur Identifizierung vieler weiterer neuer, zumeist im Golgi lokalisierter SPPL3-Substratkandidaten und legte andererseits unter physiologischen Gesichtspunkten nahe, dass SPPL3 sehr mit der Funktion des Golgi-Apparats verwoben ist. Andererseits unterstützten diese Ergebnisse sehr deutlich die formulierte Hypothese, dass SPPL3 als zelluläre Typ-II-Membranprotein-selektive Sheddase agiert. Zusammengefasst liefert diese Arbeit die erste ausführliche Charakterisierung der Intramem- branprotease SPPL3. SPPL3 zeigt erhebliche Unterschiede zu anderen Aspartylintramembran- proteasen und erweist sich damit als bedeutende zelluläre Sheddase mit einer auffälligen Selektivität für Typ-II-orientierte, im Golgi lokalisierte Membranproteine. Produkte der Endoproteolyse dieser Golgi-Proteine werden sekretiert und/oder werden möglicherweise intrazellulär degradiert, was wiederum ihre eigentliche intrazelluläre Funktion beeinträchtigt. Folglich kontrolliert SPPL3 indirekt die Proteinglykosylierung im Golgi-Apparat.