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Kleinsteuber, Ina (2015): Herstellung und Charakterisierung monoklonaler Antikörper zum Nachweis von Cronobacter spp. Dissertation, LMU München: Tierärztliche Fakultät
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Abstract

Cronobacter spp. sind opportunistische pathogene Erreger, die insbesondere nach der Aufnahme kontaminierter Lebensmittel schwere Infektionen mit hohen Letalitätsraten bei Neugeborenen und immungeschwächten Erwachsenen hervorrufen können. Um spezifische immunchemische Nachweisverfahren für diese Keimgruppe zu etablieren, wurden in der vorliegenden Arbeit monoklonale Antikörper (mAK) zum Nachweis von Cronobacter spp. generiert und umfassend charakterisiert. Zur Präparation der Immunogene wurden Cronobacter-Keime mit Polymyxin B behandelt und anschließend wurden Mäuse entweder mit dem durch Zentrifugation erhaltenem Zellpellet (Ghosts) oder mit dem zellfreien Überstand (Lysat) dieser Präparationen immunisiert. Beide Präparationen erwiesen sich als hoch immunogen, die nachweisbaren Titer lagen üblicherweise bei > 1:10.000. Insgesamt konnten 14 stabile Hybridomzelllinien (sieben je Ansatz) etabliert werden. Die Intra- bzw. Inter-Genus-Spezifität und Affinität der entsprechenden mAK wurde umfassend unter Verwendung von indirekten EIA-Verfahren überprüft. Für Studien zur Epitopspezifität der generierten mAK wurden Immunoblots und Immunfluoreszenz-Analysen eingesetzt. Alle mAK, die aus der Immunisierung mit Cronobacter-Ghosts resultierten, zeichneten sich durch ein sehr breites Reaktionsspektrum aus, Kreuzreaktionen wurden vorzugsweise mit Vertretern aus der Familie der Enterobacteriaceae aber auch mit anderen gramnegativen Keimen beobachtet. Für alle mAK konnten Proteine als antigene Determinanten identifiziert werden, die relativen Molekulargewichte reaktiver Proteinbanden lagen üblicherweise im Bereich von > 40 kDa. Demgegenüber zeigten sechs der sieben mAK, die aus der Immunisierung von Mäusen mit Polymyxin B generierten Lysat-Präparationen resultierten, eine hohe Affinität für die O-spezifische Seitenkette der Cronobacter-typischen Lipopolysaccharide (LPS): mAK 2G4 αL reagierte hochspezifisch mit dem C. turicensis-Stamm (MHI 21026; Serotyp O1). Im indirekten EIA war dieser Erreger bei Keimzahlen von ca. 104 KbE/ml noch nachweisbar. Für die weiteren fünf mAK, die alle spezifisch mit C. sakazakii des Serotyps O1 reagierten, wurden im indirekten EIA Nachweisgrenzen im Bereich von 105-107 KbE/ml ermittelt. Alle mAK gegen LPS gehören zum IgG-Subtyp und reagierten in der Immunfluoreszenz mit lebenden Cronobacter-Keimen.

Abstract

Cronobacter spp. are opportunistic pathogens that cause serious infections, characterized by high lethality rates, particularly in infants and immunocompromised adults after ingestion of contaminated food. To establish immunochemical assays for the specific detection of Cronobacter, within this study monoclonal antibodies were generated and comprehensively characterized. For the preparation of the immunogen, Cronobacter cells were first treated with polymyxin B and, subsequently, mice were immunized either with the resulting cell pellet (ghosts) obtained by centrifugation or with the cell-free supernatants (lysate) of these preparations. Both polymyxin B derived preparations were highly immunogenic, serum antibody titres were usually higher than 1:10,000. Cell fusion experiments resulted in the establishment of 14 stable hybridoma cell lines (seven per approach). Intra- and inter-genus-specificity and affinity of the mAbs were determined by using indirect enzyme immunoassays (EIA). Epitope-specificity of the generated mAbs was determined by immunoblot- and immunofluorescence techniques. All of the mAbs derived from the immunization with Cronobacter ghosts were characterized by broad reactivity towards bacteria mainly within the family Enterobacteriaceae but also to other gram-negative bacteria. For all of these mAbs proteins were identified as antigenic determinants. Reactive bands generally showed an apparent molecular weight of > 40 kDa. In contrast, using the lysate preparation as immunogen, six of the seven obtained mAbs exhibited high affinity for the O-polysaccharide chains of Cronobacter specific lipopolysaccharides (LPS): mAb 2G4 αL showed highly specific reactions with C. turicensis MHI 21026 (serotype O1). Employing this mAb in an indirect EIA, the limit of detection was at approx. 104 cfu/ml. For the other five O-antigen-specific mAbs, which interacted specifically with strains of C. sakazakii, serotyp O1, detection limits ranging from 105-107 cfu/ml were achieved. All anti-LPS mAbs were of the IgG subtype and reacted with viable Cronobacter cells as shown by immunofluorescence studies.