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Laufer, Theresa Maria (2015): Untersuchung zur Identifikation und Charakterisierung potentieller Virulenzfaktoren von Cronobacter sakazakii ES5, Investigation of the role of potential virulence factors of Cronobacter sakazakii ES5. Dissertation, LMU München: Tierärztliche Fakultät
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Abstract

Cronobacter sakazakii ist ein ubiquitäres Gram-negatives Stäbchenbakterium, das neben anderen Lebensmitteln vor allem in Milchpulver vorkommt und insbesondere bei Neonaten zu nekrotisierender Enterocolitis (NEC), Bakteriämie und Meningitis führen kann. Trotz der umfangreichen Forschung der letzten Jahre ist nach wie vor wenig über die Pathogenese von Cronobacter spp. sowie potentielle Virulenzfaktoren bekannt. Um neue Erkenntnisse über Pathogenitätsmechanismen von C. sakazakii zu erhalten, wurden in dieser Arbeit 28 Transposoninsertionsmutanten des klinischen Isolats C. sakazakii ES5 in drei unterschiedlichen Zelllinien auf ihre Fähigkeit an die eukaryotischen Zellen zu adhärieren, in sie einzudringen und in ihnen zu proliferieren, untersucht. Die inaktivierten Gene dieser Mutanten codieren für Proteine des Energiestoffwechsels, der Zellwand und des Biofilms, der Motilität der Bakterien und der Carotinoidbiosynthese. Angelehnt an den in vivo Infektionsweg von C. sakazakii - orale Infektion des Organismus, primäre lokale Infektion im Darm, systemische Infektion über die Invasion in Makrophagen und schließlich das Überschreiten der Blut-Hirn-Schranke und die Infektion des Gehirns - wurden für die Studie Caco-2 Darmepithelzellen, RAW-264.7 Makrophagen-Zellen sowie HBMEC Hirnendothelzellen ausgewählt. Beim Screening aller drei Zelllinien konnte festgestellt werden, dass die Flagellenstruktur betreffende Mutationen bei C. sakazakii ES5 zu fast 100%iger Attenuation der Invasion der Wirtszellen führen. Dies lässt auf die Bedeutung der Flagellen als Pathogenitätsfaktor schließen. Bedingt sein könnte die Attenuierung durch die verminderte Motilität der Bakterien, durch die instabile Interaktion von Flagellen mit den eukaryotischen Zellen selbst oder möglicherweise durch die fehlende Sekretion von Virulenzfaktoren durch das Typ-III-Flagellen-Sekretionssystem. Weiterführende Untersuchungen zu der Motilität der Transposoninsertionsmutanten zeigten, dass die Flagellenfunktion bei C. sakazakii ES5 durch Suppression reguliert zu sein scheint, da die bei C. sakazakii ES5 vorhandene Hemmung des Flagellen-vermittelten Swimmings im Weichagar z.B. unter Zugabe von steril filtriertem Überstand einer C. sakazakii ES5-Kultur wieder aufgehoben werden konnte. Des Weiteren fielen zwei Mutanten mit verminderter Serumresistenz durch reduzierte Virulenz auf, sowie eine Mutante, deren unterbrochenes Gen für einen putativen Reifungsfaktor der 30S-Untereinheit der Ribosomen codiert. Bei diesen drei Mutanten könnten die inaktivierten Gene für potentielle Virulenzfaktoren codieren und sollten näher untersucht werden. Transposonmutanten aus der orthologen Gruppe für Energiestoffwechsel zeigten ebenfalls eine verminderte Invasion. Diese Stämme hatten bei der biochemischen Charakterisierung der Metabolisierung definierter Kohlenstoffquellen bei den Aminosäuren und den Zwischenprodukten des Intermediärstoffwechsels ein vom Wildtyp ES5 abweichendes Metabolisierungsmuster. Die Unterbrechungen im Citratzyklus führten z.B. zur schwächeren Verstoffwechselung von L-Glutamat, dafür wurde L-Asparagin besser als Substrat verwertet. Somit konnte die Fähigkeit zur Anpassung durch Umstellung des Metabolismus bei C. sakazakii ES5 bestätigt werden. Weiterhin ergab der Vergleich des Kohlenstoff-Metabolismus von Cronobacter spp. mit dem von Salmonella enterica sv. Typhimurium einige interessante Unterschiede: C. sakazakii konnte im Gegensatz zu S. Typhimurium eine Vielzahl in der Umwelt vorkommender C-Quellen zur Energiegewinnung nutzen, was darauf schließen lässt, dass das ubiquitäre Bakterium Cronobacter spp. ursprünglich mit Pflanzen assoziiert war. Glucose-6-Phosphat, ein wichtiges Stoffwechselzwischenprodukt, das bei pathogenen Enterobacteriaceae neben Glucose und Mannose intrazellulär als die bevorzugte Kohlenstoffquelle gilt, wurde von C. sakazakii dagegen in vitro nicht metabolisiert. Es bleibt zu klären, ob C. sakazakii in der Lage ist, intrazellulär seinen Stoffwechsel umzustellen und Glucose-6-Phosphat als C-Quelle zu nutzen. C. sakazakii ist ein gelb pigmentiertes Bakterium und synthetisiert die Pigmente über Carotinoid-Biosynthese. In den Infektionsversuchen zeigte sich, dass pigmentlose Mutanten in der Invasion von RAW-264.7-Zellen attenuiert sind. In diesem Zusammenhang konnte auch festgestellt werden, dass bei der de novo Carotinoid-Synthese das CrtY-Protein (Lycopin-ß-Cyclase) die ß-Cyclisierung von Lycopin zu ß-Carotin ausführt. Nach Komplementierung der crtY-Mutante zeigte sich erneut die wildtypische gelbe Pigmentierung der Bakterienkolonien von C. sakazakii ES5crtY::Tn5/pUC19-crtY, anstatt der pinken Koloniefärbung der Mutante. Die Reduzierung der Invasion in HBMEC-Zellen um mehr als 30% konnte durch die Komplementation des crtY-Gens aufgehoben werden: die konstitutive Expression des Gens führte zu einem Invasionswert von 122% des Wildtyps. Im Rahmen dieser Arbeit konnten durch Infektionsexperimente in drei Zelllinien der Infektionsweg von C. sakazakii ES5 nachgestellt, neue potentielle Virulenz-assoziierte Faktoren identifiziert und die Fähigkeit der spezifischen Anpassung an das intrazelluläre Milieu als ein wichtiges Pathogenitätsmerkmal bestätigt werden.

Abstract

Cronobacter sakazakii is an opportunistic Gram-negative food-borne pathogen, which is mainly a problem in powdered infant formula (PIF), because of its ability to cause severe necrotizing enterocolitis (NEC), septicemia and meningitis in neonates. Despite the efforts over the last years, still little is known about the pathogenesis of C. sakazakii and its crucial virulence mechanisms. To gain further insight about pathogenic mechanisms of C. sakazakii, 28 mutants of the clinical strain C. sakazakii ES5 have been screened in this study for their potential to adhere, invade and proliferate in eukaryotic cells. The inactivated genes encode for proteins playing a role in energy production and conversion, as well as in cell membrane biogenesis, biofilm-formation, motility and carotenoid biosynthesis. Reflecting the course of infection of C. sakazakii in vivo - oral infection of the host organism, primary local infection of the gastro-intestinal tract (GIT), systemic spread by invading in macrophages and finally crossing the blood-brain-barrier (BBB) and infecting the brain - three cell lines Caco-2 gastrointestinal epithelial cells, RAW-264.7 as mononuclear phagocytic cells, and HBMEC brain-micro-endothelial were selected as cell culture study system. The screening in all three cell lines showed reduced invasion by nearly 100% of both flagella mutants without or short and brittle flagella. This suggests that flagella are important for the pathogenesis of Cronobacter. The attenuation might be caused by reduced motility, instable interaction between flagella and the host cell or missing secretion of virulence factors through the Type III flagellar secretion system. Further investigations using motility-assays showed that flagellar motility of C. sakazakii seems to be regulated by suppression. Typically, in motility assays, flagella-induced swimming of C. sakazakii ES5 is inhibited, but e.g. upon addition of sterile-filtrated supernatant of a C. sakazakii ES5 culture, swimming was observed. Two mutants with reduced resistance to serum showed decreased virulence, as well as one mutant in which a putative ribosome maturation factor for the 30S ribosomal subunit was disrupted. The inactivated genes of these three mutants could encode potential virulence factors and have to be investigated in detail. Mutants from the orthologous group for energy production and conversion were also less invasive in eukaryotic cells. In the utilization of carbon sources, in particular of amino acids and intermediary catabolic products, those strains differ from the wild type strain. For instance, disruption of the citrate cycle, led to a decreased usage of L-glutamic acid, but increased the catabolism of L-asparagine. This showed that C. sakazakii ES5 was able to efficiently adapt its metabolism in response to the mutation. In comparison with Salmonella enterica serovar Typhimurium, the carbon metabolism of C. sakazakii showed several interesting differences: in contrast to S. Typhimurium, Cronobacter spp. was able to use a variety of carbon sources present in soil. This suggests that Cronobacter spp. might be descended form a common ancestor that had plant-associated lifestyle. Surprisingly, glucose-6-phosphate, which is known to be the preferred intracellular carbon source of enterobacterial pathogens, besides glucose and mannose, could not be used as carbon source by C. sakazakii in vitro. It would be interesting to investigate, if intracellular C. sakazakii is able to modify its metabolism for using glucose-6-phosphate inside the host. C. sakazakii is a yellow pigmented bacteria species that synthesizes its pigments by carotenoid biosynthesis. Infection assays showed attenuation of colorless strains in invasion of RAW-264.7 cells. In this context, it was determined that in de novo carotenoid synthesis CrtY protein catalyzes the reaction of lycopene to ß-carotene. After complementation, the crtY-mutant showed the typical yellow pigmentation of wild-type colonies, instead of the pink mutant colonies. The reduced invasion of HBMEC cells by more than 30% in comparison with wild-type cells could also be restored by complementation. Constitutive expression of the crtY gene in the mutant background led to an increased invasion of HBMEC cells of 122% compared to ES5 wild-type cells. In this study, C. sakazakii ES5 infection experiments of three different cell lines were used to identify new virulence-associated factors and to investigate the ability of C. sakazakii to specifically adapt to the intracellular environment, which represents a crucial feature for its pathogenic lifestyle.