Charakterisierung cAMP-unabhängiger Effektoren des Thyreotropin-Rezeptors in humanen Schilddrüsenkarzinom-Zelllinien

Stohr, Stefanie (2014): Charakterisierung cAMP-unabhängiger Effektoren des Thyreotropin-Rezeptors in humanen Schilddrüsenkarzinom-Zelllinien. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Der humane Thyreotropin-Rezeptor (TSH-R) steuert die zentralen Funktionen der Schilddrüse und ist der wichtigste Regulator für deren Wachstum und Differenzierung. Er gehört zur Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) und kann nach einer Stimulation mit TSH die G-Proteine aller vier Familien (Gs, Gi/o, Gq/11 und G12/13) aktivieren. Dabei werden die meisten zellulären Reaktionen wie die Proliferation der Schilddrüsenepithelzellen und die Bereitstellung der Schilddrüsenhormone einer Aktivierung von Gs zugeordnet. Zu Gs-unabhängigen Signalwegen des TSH-R war dagegen erst wenig bekannt. Da der Gq/11-vermittelte Signalweg durch die Aktivierung der Phospholipase C und Proteinkinase C in maligne Prozesse von Schilddrüsenzellen involviert sein könnte, sollten in der vorliegenden Arbeit Gq/11-abhängige Effektoren des TSH-R in humanen Schilddrüsenkarzinomzellen identifiziert und näher charakterisiert werden. Als Modellsystem wurden FTC 133 wt TSH-R Zellen verwendet, eine follikuläre Schilddrüsenkarzinom-Zelllinie, die den humanen TSH-R überexprimiert. In diesen wurde die Aktivierung des Calcium/Calcineurin-abhängigen Transkriptionsfaktors NFAT nach TSH-Stimulation erstmalig beschrieben. Bei einer anschließenden Reihenuntersuchung der NFAT-abhängigen Zielgene Autotaxin, VEGF, c-Myc, Regulator von Calcineurin 1 (RCAN1) und Cyclooxygenase-2 (Cox-2) wurden c-Myc, RCAN1 und Cox-2 als TSH-regulierte Gene identifiziert. Die Induktion von c-Myc war unabhängig von NFAT, dagegen bestätigten Expressionsstudien mit Calcineurin-Inhibitoren und dem spezifischen NFAT-Inhibitor INCA-6, dass RCAN1 und Cox-2 durch eine NFAT-Aktivierung induziert wurden. Diese Aktivierung wurde durch Gq/11-Proteine vermittelt, denn nach spezifischer Herunterregulation der Gq- und G11-α-Untereinheiten mittels siRNA konnten die Zielgene nicht mehr TSH-abhängig induziert werden. Weitere Analysen zum Mechanismus der NFAT-Aktivierung zeigten, dass eine Erhöhung der intrazellulären Calciumionenkonzentration ([Ca2+]i) allein über intrazelluläre Speicher nicht ausreichend war. Um NFAT zu aktivieren, mussten zusätzlich Calciumionen aus dem Extrazellulärraum einströmen. Untersuchungen mit dem STIM1-Inhibitor SKF-96365 wiesen dabei auf einen Calciumioneneinstrom über Speicher-operierte Ionenkanäle hin. Zusätzlich zur NFAT-regulierten Genexpression wurde in dieser Arbeit die TSH-induzierte Expression des Metallothioneins MT1X in FTC 133 wt TSH-R Zellen und in primären Thyreozyten analysiert. Die mRNA Induktion dieses Cystein-reichen und zytoprotektiven Proteins war ebenfalls abhängig von einer Expression der Gq/11-Proteine. Eine Erhöhung der [Ca2+]i reichte jedoch nicht aus, um MT1X signifikant zu induzieren. Zur gesteigerten Expression war darüber hinaus auch die Aktivierung der Proteinkinase C notwendig. In der vorliegenden Dissertation konnten somit RCAN1, Cox-2 und MT1X als Gq/11-regulierte Zielgene des humanen TSH-R charakterisiert werden. Dabei wurde eine NFAT-regulierte Genexpression nach einer TSH-Stimulation erstmalig gezeigt. Die präsentierten Ergebnisse weisen damit auf eine bisher unbeachtete biologische Rolle von Gq/11-abhängigen Signalwegen des humanen TSH-R in der Schilddrüse hin.

Abstract

The human thyrotropin receptor (TSH-R) controls main functions of the thyroid gland and is the most important regulator of its growth and differentiation. The TSH-R belongs to the superfamily of G protein-coupled receptors (GPCR). After stimulation with TSH, it activates G proteins of all four families (Gs, Gi/o, Gq/11 and G12/13). So far, most cellular reactions, e. g. growth of follicular epithelial cells or supply of thyroid hormones, have been attributed to Gs activation. Gs-independent signalling however was largely unknown. Because Gq/11-dependent signalling by activating phospholipase C (PLC) and protein kinase C (PKC) may be involved in malignant processes of follicular epithelial cells, the aim of the present investigation was to identify and characterise Gq/11-regulated effectors of TSH-R. In order to do so, the follicular thyroid cancer cell line FTC 133 wt TSH-R, which overexpresses human TSH-R, was used as a model system. In these cells, activation of the calcium/calcineurin-dependent transcription factor NFAT after TSH stimulation was described for the first time. A subsequent analysis of the putative NFAT-dependent target genes autotaxin, VEGF, c-Myc, Regulator of Calcineurin 1 (RCAN1), and Cyclooxygenase 2 (Cox-2) identified TSH-induced expression of c-Myc, RCAN1, and Cox-2. Studies with calcineurin inhibitors and the specific NFAT inhibitor INCA-6 revealed that induction of c-Myc was independent of NFAT, whereas increased expression of RCAN1 and Cox-2 by TSH depended on NFAT. Furthermore, TSH-dependent NFAT activation was mediated by Gq/11 proteins, since a specific siRNA knockdown of Gq and G11 α-subunits prevented induction of the target genes by TSH. Analysis of the mechanism leading to TSH-induced NFAT activation revealed, that an increase of intracellular calcium ion concentration ([Ca2+]i) by internal stores alone was not sufficient to activate NFAT but required an additional influx of extracellular calcium ions. Investigations with STIM1 inhibitor SKF-96365 indicated an influx through store-operated calcium channels. In addition to NFAT-regulated gene expression, TSH-induced expression of metallothionein MT1X was analyzed in the present work. mRNA induction of this cystein-rich and cytoprotective protein was also dependent on Gq/11-proteins, but elevation of [Ca2+]i was not sufficient to induce MT1X significantly. Moreover, activation of proteinkinase C (PKC) was required for increased MT1X expression. In conclusion, RCAN1, Cox-2 and MT1X were determined as Gq/11-dependent target genes of human TSH-R in a suitable cell model of the thyroid gland. Furthermore, NFAT-dependent gene expression as a result of TSH stimulation was shown for the first time. These interesting new data point to a so far unappreciated biological role on Gq/11-dependent TSH-R signalling in the thyroid.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: TSH-R, TSH, G-Proteine, GPCR, Gq, Schilddrüsenkarzinom, NFAT, RCAN1, Cox-2, MT1X
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 24. Juni 2014
• 1. Bericht­erstatter:in: Mückter, Harald