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Weber, Nele (2014): Akrosomale Exozytose von Säugerspermien: das synaptische Multidomänenprotein RIM2α als molekularer Knotenpunkt eines regulatorischen Protein-Netzwerkes. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät
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Abstract

Für die erfolgreiche Befruchtung einer Eizelle ist die Calcium-regulierte Akrosomreaktion des Spermiums eine essentielle Voraussetzung. Sie bewirkt nicht nur die seit langem bekannte Freisetzung hydrolytischer Enzyme aus dem akrosomalen Vesikel zur Penetration der Eihülle (Zona pellucida), sondern legt auch das für die Spermien-Oozyten-Erkennung notwendige Izumo-Protein auf der Spermienoberfläche frei. Erst durch die nach Eizellkontakt induzierte großflächige Verschmelzung von äußerer akrosomaler Membran und der darüber liegenden Plasmamembran an hunderten von Fusionsstellen wird genügend Izumo-Protein auf der inneren akrosomalen Membran exponiert, um eine stabile Verbindung mit dem kürzlich auf der Eizelloberfläche identifizierten Interaktionspartner Juno zu gewährleisten. Welche Regulationsmechanismen der Koordination dieser multiplen Einzelfusionsereignisse bei der Akrosomreaktion zugrunde liegen, ist bislang jedoch weitgehend ungeklärt. In Neuronen wird die Präzision der Calcium-regulierten Neurotransmitter-Exozytose durch die cytomatrix of the active zone (CAZ), einem Netzwerk aus SNARE-regulierenden Gerüstproteinen, koordiniert. Aufgrund der funktionellen Parallelen zwischen den Exozytoseprozessen in Neuronen und Spermien sollte in der vorliegenden Arbeit geprüft werden, ob in Spermien ein analoges, CAZ-ähnliches Proteinnetzwerk die sich Reißverschluss-artig ausbreitende, multiple Fusionsporenbildung der Akrosomreaktion kontrolliert. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass das RIM2α-Protein die Hauptisoform der RIM-Proteinfamilie in Säugerspermien darstellt, deren Vertreter seit einiger Zeit als molekulare Knotenpunkte des CAZ-Proteinnetzwerkes an der Präsynapse gelten. Neben RIM2 wurde auch für ubMunc13-2, das in dieser Arbeit als prädominanter Subtyp der Munc13-CAZ-Proteinfamilie in Spermien identifiziert wurde, sowie für die beiden riesigen Gerüstproteine Piccolo/Aczonin und Bassoon eine distinkte Lokalisation in der akrosomalen Region von Nagerspermien nachgewiesen. Des Weiteren konnte belegt werden, dass RIM2 und ubMunc13-2 an Detergens-resistente Membranmikrodomänen in Spermien assoziiert sind, die seit einiger Zeit für die Rekrutierung der SNARE-Fusionsmaschinerie in Spermien bekannt sind. Eine potentielle Netzwerk-bildende Funktion von RIM2 wurde in in vitro Bindungsstudien, die u. a. mit massenspektrometrischen Analysen kombiniert wurden, bestätigt. Dabei zeigte sich, dass RIM2α sowohl testikuläres ubMunc13-2 als auch die CAZ-Proteine RIM-BP3 und das erstmals in Reproduktionsgewebe nachgewiesene ELKS/ERC2 sowie einige Zytoskelett-assoziierte Proteine bindet. Die funktionelle Bedeutung eines CAZ-ähnlichen Netzwerkes für die Akrosomreaktion wurde in quantitativen Exozytose-Analysen an epididymalen Spermien verifiziert. Eine selektive Blockierung einzelner Domänen von RIM2, aber auch von ubMunc13-2 und Piccolo/Aczonin reduzierte die Calcium-induzierte akrosomale Exozytoserate um mindestens 45 %. Die Funktion der α Isoform des RIM2-Proteins konnte durch funktionelle Exozytosestudien an RIM2α-defizienten Spermien einer entsprechenden Gen-defizienten Mauslinie verifiziert werden. Interessanterweise führte eine Erhöhung der intrazellulären Calcium-Konzentration durch das Calcium-Ionophor A23187 zu keinem signifikanten Unterschied der Akrosomreaktion von RIM2α-defizienten im Vergleich zu Wildtyp-Spermien. Dieser Befund könnte möglicherweise auf eine kompensatorische Wirkung anderer, ebenfalls in Spermien exprimierter RIM1- und RIM2-Isoformen zurückzuführen sein. Allerdings wurde für die Akrosomreaktion nach Stimulation mit isolierter und solublisierter Zona pellucida in RIM2α-defizienten im Vergleich zu Wildtyp-Spermien eine signifikante Reduzierung der akrosomalen Exozytose-Induktion festgestellt. Da die Applikation eines Calcium-Ionophors die Signalkaskade umgeht, die unter physiologischen Bedingungen zum Calcium-Influx und damit zur Membranfusion führt, scheint das RIM2α-Protein Komponenten der Signalkaskade und/oder die Calcium-Kanäle für die Akrosomreaktion zu rekrutieren. Somit könnte es dazu beitragen die gerichtete, großflächige Fusionsporenbildung nach Zona pellucida-Stimulation zu gewährleisten. Im Rahmen dieser Dissertation durchgeführte Untersuchungen deuten außerdem an, dass RIM2α eine Interaktion mit dem Multi-PDZ-Domänen Protein 1 (MUPP1) eingehen könnte. MUPP1 ist im Komplex mit der Calcium/Calmodulin abhängigen Kinase II daran beteiligt, eine spontane, durch die sekundäre Reifung der Spermien im weiblichen Genitaltrakt begünstigte Akrosomreaktion zu verhindern. Als molekularer Knotenpunkt könnte RIM2 demnach sowohl eine spontane Exozytose verhindern als auch durch die Rekrutierung weiterer CAZ-Proteine und des Zytoskeletts die großflächige, multiple Fusionsporenbildung zur Freilegung von ausreichend Izumo-Molekülen auf der Spermienoberfläche sicherstellen. Eine Lokalisation in Detergens-resistenten Membranplattformen, wie sie auch für MUPP1 und die SNARE-Proteine in Spermien gezeigt wurde, könnte diese integrierende Funktion von RIM2 für die akrosomale Exozytose unterstützen.

Abstract

The acrosome reaction has two key functions that ensure successful fertilization. Firstly, the release of hydrolyzing enzymes from the acrosomal vesicle is necessary for the sperm to penetrate the egg’s glycoprotein matrix, the zona pellucida. Secondly, the exposure of the oocyte recognition protein Izumo on the sperm’s surface is important for the final fusion with the oocyte. Upon oocyte contact, an extensive merge of the outer acrosomal membrane and the overlaying plasma membrane at hundreds of distinct fusion sites is induced and serves to uncover sufficient Izumo-protein for stable pairing of Izumo and the recently identified oocyte counterpart Juno. To date, the regulatory mechanism(s) that coordinate(s) this multipoint membrane fusion during acrosome reaction are poorly understood. In neuronal presynaptic termini, precision of vesicle fusion is coordinated by components of the cytomatrix of the active zone (CAZ) – a network of SNARE-regulating scaffold proteins. Due to the functional parallels between exocytosis in neurons and sperm, the aim of the present work was to investigate if an analogous CAZ-like protein network controls the zipper-like propagation of multipoint membrane fusion during acrosome reaction in sperm. Of the RIM-family of CAZ-proteins which recently have been shown to be central coordinators of the neuronal CAZ-network, the RIM2α-protein was found to be the predominant sperm isoform. A distinct localization in the acrosomal region of rodent sperm was observed for RIM2 and ubMunc13 2, which was identified as the major sperm isoform of the Munc13 CAZ-protein family, as well as the giant scaffold proteins Piccolo/Aczonin and Bassoon. Moreover, RIM2 and ubMunc13-2 were found to be associated to detergent-resistant membrane micro domains known to cluster the SNARE fusion machinery in sperm. A potential networking function of RIM2 was addressed in in vitro interaction studies combined with tandem mass spectrometry analyses. Thereby, the CAZ-proteins ubMunc13-2, RIM-BP3 and ELKS2/ERC2, which was identified for the first time in reproductive tissue, as well as several cytoskeleton-associated proteins were found to be testicular binding partners of RIM2. The functional role of a potential CAZ-like protein network during acrosomal exocytosis was verified in quantitative exocytosis studies using epididymal sperm. The selective block of distinct binding modules of either RIM, Munc13 or Piccolo/Aczonin resulted in a significant reduction of calcium-induced acrosomal exocytosis of at least 45 %. The functional significance of the α-isoform of RIM2-proteins was further examined in functional exocytosis experiments using RIM2α-deficient sperm of a gene-deficient mouse line. Interestingly, following an increase of the intracellular calcium concentration byway of the addition of the calcium ionophor A23187, only a slight difference in acrosomal exocytosis between wild-type and RIM2α-deficient spermatozoa was observed. This might be due to compensatory effects of other RIM1- and RIM2-isoforms expressed in sperm. In contrast, potentiation of acrosome reaction rates determined upon stimulation with isolated, solubilized zona pellucida was found to be significantly reduced in RIM2α-deficient compared to wild-type sperm. Because the application of a calcium ionophor bypasses zona pellucida-induced signaling, leading to calcium influx and membrane fusion, the results indicate that RIM2α in spermatozoa recruits components of the signal transduction pathway and/or calcium channels to ensure the extensive, directed multipoint membrane fusion observed with zona pellucida stimulation. Besides this coordination of membrane fusion, the present work also provides evidence for RIM2 as part of a complex consisting of the multi PDZ domain protein 1 (MUPP1) and the calcium/calmodulin-dependent protein kinase II. This complex has been shown to be important for arresting spontaneous acrosomal exocytosis occurring as a result of secondary sperm maturation in the female reproductive tract. Therefore, RIM2 might represent the molecular backbone for preventing spontaneous exocytosis as well as recruiting additional CAZ-proteins and cytoskelettal proteins for successful membrane fusion, ensuring the exposure of sufficient Izumo molecules on the sperm surface. RIM2’s localization in detergent-resistant membrane platforms, which has also been observed for MUPP1 and SNARE-proteins in sperm, could support an integrating function of RIM2 for acrosomal exocytosis.