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Gallinger, Christoph (2014): Ste20-like kinases and regulator proteins in the cytoskeleton of Dictyostelium discoideum. Dissertation, LMU München: Fakultät für Biologie
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Abstract

The cytoskeleton in most eukaryotes consists of actin filaments, intermediate filaments, microtubules and specific associated proteins. It determines the shape and the polarity of a cell and is inevitable for the coordination of cell movement. The regulation of this complex structure requires a highly organised and specialised signalling network. Ste20-like kinases and the regulator protein Mo25 (Morula protein 25) are part of this signalling network. The main objective of this work was the functional characterisation of the regulator protein Mo25 and the Ste20-like kinases Fray1, Fray2 (Frayed kinase 1/2) and DstC (Dictyostelium serine threonine kinase C) in the amoeba Dictyostelium discoideum (D. discoideum). An additional project was to map and characterise the actin and actin related genes in the genome of the fresh water foraminifer Reticulomyxa filosa (R. filosa). Mo25 is a highly conserved 40 kDa scaffolding protein with a 60% identity from amoeba to man. The disruption of the mo25 gene in D. discoideum results in very large, multinucleated cells which are unable to complete cytokinesis. Growth as well as development is severely delayed in the Mo25-minus strain. Furthermore, in phototaxis assays performed with multicellular aggregates (slugs), the Mo25-minus slugs were unable to migrate towards the light source. These findings imply that Mo25 plays an important role in cytokinesis, growth and cell polarity. We could link the Ste 20-like kinase SvkA (severin kinase), a homolog of the human Mst3, Mst4 (Mammalian Ste20-like kinase 3/4) and Ysk1/Sok1 (Yeast Sps1/Ste20-related kinase 1, Suppressor of Kinase 1) kinases to Mo25 as a binding partner. To further elucidate the interaction of Mo25 with SvkA as well as their role in cytokinesis or polarity signalling, we generated a series of GFP–Mo25 rescue constructs with distinct point mutations in protein-protein interaction surfaces and transformed these into the Mo25-minus background. The kinase domains of the Ste20-like kinases, Fray1 and Fray2 in D. discoideum are highly homologous to the catalytic domains of OSR1 (Oxidative stress response kinase 1) and SPAK (Ste20/SPS1-related proline-alanine-rich protein kinase) in humans and Frayed in fruit fly. Here, we generated the knockout clones Fray1-minus, Fray2-minus, and the double knockout Fray2Fray1-minus in D. discoideum. In developmental studies, Fray2-minus did not show an altered phenotype, whereas Fray1-minus and Fray2Fray1-minus developed slightly slower into fruiting bodies. When grown in shaking culture, Fray1-minus and Fray2Fray1-minus showed a reduced growth rate compared to Fray2-minus and the wild type. In addition, by using a GFP-Trap resin we identified a binding partner of Fray1, a yet unknown protein that we named FRIP (Fray Interacting Protein). FRIP mainly consists of a CBS (Cystathionine beta synthase) domain pair and is 30% identical to the gamma subunit of the AMPK (5‘ adenosine mono phosphate-activated protein kinase) complex in D. discoideum. The Ste20-like kinase DstC has been described to be a regulator of the actin driven process of phagocytosis. The catalytic domain of DstC is most similar to the mammalian kinase Mst2 (Mammalian Ste20-like kinase 2) and Hippo (“Hippopotamus”-like phenotype) of D. melanogaster. We could map the sorting signal that localises DstC to phagocytic cups and acidic vesicles to about 90 amino acids. Here we present an array of distinct point mutations for the identification of the exact localisation signal. R. filosa is a fresh water protist which belongs to the the group of Foraminifera within the Rhizaria. The R. filosa genome is the first foraminiferal and only the second rhizarian genome to be deciphered. In this bioinformatics project, we could identify, map and characterise four new actin genes in addition to the already known actin and about 40 genes that code for potential actin related proteins of seven different protein classes.

Abstract

Das eukaryotische Zytoskelett besteht in der Regel aus Aktinfilamenten, Intermediärfilamenten, Mikrotubuli und spezifischen assoziierten Bindeproteinen. Es bestimmt Form und Polarität einer Zelle und ist damit maßgeblich an der Koordination der Zellbewegung beteiligt. Die Regulation dieser komplexen Vorgänge erfordert ein hoch spezialisiertes und organisiertes Signalsystem. Ein Teil dieses Signalsystems sind die Ste20-ähnlichen Kinasen und Mo25 (Morula protein 25), ein struktureller Organisator von Kinasen im Zytoskelett. Das Hauptziel dieser Arbeit war die funktionelle Charakterisierung des Proteins Mo25 und der Ste20-ähnlichen Kinasen Fray1, Fray2 (Frayed kinase 1/2) und DstC (Dictyostelium serine threonine kinase C) der sozialen Amöbe Dictyostelium discoideum (D. discoideum). Ein weiteres Projekt war die Kartierung und Charakterisierung der Aktine und Aktin verwandten Gene im Genom des Süßwasser Foraminiferen Reticulomyxa filosa (R. filosa). Das hoch konservierte, 40 kDa große Regulatorprotein Mo25 der Amöbe D. discoideum ist zu 60% identisch zu seinem Homolog im Menschen. Durch die Disruption des mo25-Gens in D. discoideum bilden sich sehr große, mehrkernige Zellen, welche sich nicht mehr normal teilen können. Das Wachstum, wie auch die Vollendung des Entwicklungszyklus sind in der Mo25-minus Mutante stark eingeschränkt. Ferner können sich die mehrzelligen Aggregate, die sogenannten „slugs“, in Phototaxis Experimenten nicht in Richtung einer Lichtquelle bewegen. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass Mo25 eine wichtige Rolle bei Zellteilung, Wachstum und Zellpolarität spielt. Wir konnten die Ste20-ähnliche Kinase SvkA (Severin kinase), ein Homolog der menschlichen Kinasen Mst3, Mst4 (Mammalian Ste20-like kinase 3/4) und Ysk1/Sok1 (Yeast Sps1/Ste20-related kinase 1, Suppressor of Kinase 1), als einen Bindepartner von Mo25 verifizieren. Um die Wechselwirkung von Mo25 mit SvkA näher zu untersuchen, erzeugten wir eine Reihe von GFP-Mo25 Konstrukten mit verschiedenen Punktmutationen in den Protein-Protein Interaktionsflächen und brachten diese in die Mo25-minus Zelllinie ein. Daraufhin untersuchten wir die verschieden Auswirkungen der Punktmutationskonstrukte auf Zellteilung und Zellpolarität. Die Kinase-Domänen der Ste20-like-Kinasen, Fray1 und Fray2 der Amöbe D. discoideum weisen eine hohe Ähnlichkeit zu den katalytischen Domänen von OSR1 (Oxidative stress response kinase 1) und SPAK (Ste20/SPS1-related proline-alanine-rich protein kinase) im Menschen und zu Frayed in der Fruchtfliege Drosophila melanogaster (D. melanogaster) auf. Die Disruption der Gene fray1, fray2 einzeln und fray2 und fray1 zusammen ergab keine Veränderung im Phänotyp von D. discoideum. Auch der Entwicklungszyklus verlief im Vergleich zum Wildtyp nahezu unverändert. Lediglich beim Wachstum in Schüttelkultur zeigten die Fray1-minus und Fray2Fray1-minus Mutanten eine leicht verringerte Wachstumsrate im Vergleich zum Fray2-minus Stamm und dem Wildtyp. Zusätzlich konnte ein bisher unbekanntes Protein als Bindungspartner von Fray1 identifiziert werden, welches wir FRIP (Fray interacting protein) genannt haben. FRIP besteht hauptsächlich aus zwei CBS (Cystathionine beta synthase)-Domänen Paaren und ist zu 30% identisch zu der gamma-Untereinheit des AMPK (5‘ adenosine mono phosphate-activated protein kinase)-Komplexes in D. discoideum. Die Ste20-ähnliche Kinase DstC wurde als Regulatorprotein des Aktin-gesteuerten Prozesses der Phagozytose beschrieben. Die katalytische Domäne von DstC ist der homologen Domäne der Säugerkinase Mst2 (Mammalian Ste20-like kinase 2) und der Kinase Hippo (“Hippopotamus”-like phenotype) aus der Fruchtfliege sehr ähnlich. Wir konnten das Signal, welches DstC an den Zellmund und an angesäuerte Vesikel in D. discoideum lokalisiert, auf etwa 90 Aminosäuren eingrenzen. Hier präsentieren wir eine Zusammenstellung verschiedener Punktmutationen zur Veränderung der Aminosäuren, welche potentiell für die subzelluläre Lokalisierung des Proteins wichtig sind. R. filosa ist ein einzelliger Frischwasser Protist aus der Gruppe der Foraminiferen innerhalb der Rhizarien. Das R. filosa Genom ist das erste vollständig sequenzierte Genom der Foraminiferengruppe und erst das zweite der Rhizarien. In diesem bioinformatischen Projekt war es die Aufgabe, Aktin und Aktin-ähnliche Gene im Genom von R. filosa zu finden und zu kartieren.