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Deutsch, Marcus-André (2014): Charakterisierung des kardioregenerativen Potenzials adulter humaner endothelialer Progenitorzellen vom Typ ECFC im Infarktmodell der SCID/Beige-Maus. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät
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Abstract

Akute und chronische Myokardischämien ziehen einen irreversiblen Verlust an funktionellem Myokard nach sich und sind mit weitreichenden strukturellen Umbauprozessen am verbleibenden Myokard assoziiert. Häufig entwickelt sich eine progrediente Herzinsuffizienz. Aus Ermangelung an kurativen Behandlungsmöglichkeiten, der schlechten Prognose sowie der immensen sozioökonomischen Bedeutung leitet sich die dringliche Notwendigkeit für die Entwicklung neuer, alternativer Therapiestrategien ab. Vielversprechend erscheint das innovative therapeutische Konzept der zellbasierten myokardialen Regeneration, das zum Ziel hat, über eine Applikation von Stamm- und Progenitorzellen irreversibel verlorengegangene Herzmuskelzellen funktionell zu ersetzen bzw. die Formation neuer Gefäße im geschädigten Herzmuskel zu bewirken. In der vorliegenden Arbeit wurde das kardioregenerative Potenzial von ECFCs, einer neuartigen, bisher im myoregenerativen Kontext wenig charakterisierten endothelialen Progenitorzellpopulation, die aus dem peripheren Blut von KHK-Patienten isoliert wurde, in einem murinen Myokardinfarktmodell untersucht. Unmittelbar nach experimenteller, durch LAD-Ligation realisierter Infarktinduktion wurden 5x105 ECFCs in die Infarktrandzone verabreicht. Versuchstiere der Kontrollgruppe erhielten eine Injektion mit isotoner Kochsalzlösung. Im Vergleich zur Kontrollgruppe führte die intramyokardiale Transplantation von ECFCs zu einer signifikanten Verbesserung der hämodynamischen Funktionsparameter, insbesondere der linksventrikulären Auswurffraktion, sowie einer günstigen Beeinflussung des postischämischen kardialen Remodelings, die sich in geringeren Infarktgrößen bei den behandelten Tieren widerspiegelte. Eine direkte Beteiligung der Zellen an der Neoangiogenese oder eine myokardiale Differenzierung konnte in der vorliegenden Arbeit nicht nachgewiesen werden. Dennoch zeigte sich im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe eine deutliche Verbesserung der Vaskularisationsdichte nach Zelltransplantation. In der durchflusszytometrischen Analyse der myoztendepletierten Zellfraktionen der Herzen der Versuchstiere 2 Tage nach Infarktinduktion und Zelltransplantation konnte eine im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe deutliche Steigerung der Zahl von CD45-/CD34-/Sca1+ kardial-residenten Stammzellen im Herzen nachgewiesen werden. Dieser indirekte und bislang in der Literatur nicht beschriebene Mechanismus könnte, neben anderen parakrinen Effekten, hauptverantwortlich für die beobachteten positiven Effekte auf Hämodynamik und Remodeling sein. In der Zusammenschau können die beobachteten Effekte am ehesten als Folge sekundär eingewanderter (pro-) angiogener Zellen sowie über positive parakrine Einflüsse auf kardial-residente Stammzellen und ortsständige Endothelzellen mit dem Resultat einer verbesserten postischämischen Neovaskularisation interpretiert werden. In der Subgruppenanalyse scheint die diabetische Stoffwechsellage der Spenderpatienten die zelltherapeutischen Effekte im Tiermodell nicht zu limitieren. Die gemachten Beobachtungen lassen den Schluss zu, dass von der Transplantation von ECFCs nach Myokardischämie ein relevantes therapeutisches Potenzial ausgeht. Die in der vorliegenden Arbeit gemachten Beobachtungen bezüglich des Engraftments der transplantierten Zellen bestätigen die Befunde in der Literatur und verdeutlichen, dass zukünftig weitere Maßnahmen zur Steigerung des permanenten Engraftments ergriffen werden müssen, um die Effekte der Zelltherapie zu maximieren. Weitere Studien müssen detailliertere Einblicke in die genauen Mechanismen der Wirkungsweise von ECFCs bei der Therapie des akuten MIs und den Einfluss von kardiovaskulären Risikofaktoren auf die Funktionalität der zu transplantierenden Zellen erbringen.

Abstract

Objective: The potential therapeutic role of EPCs in ischemic heart disease is subject to intense investigation. It has been shown that the transplantation of unfractioned bone marrow stem cells after myocardial infarction (MI) is moderately effective. Selected stem cell populations may further optimize treatment. The aim of the study was to investigate the pro-regenerative potential of human endothelial colony-forming cells (ECFCs), a very homogenous and highly proliferative endothelial progenitor cell subpopulation, in a murine MI model. Methods: CD34+ peripheral blood mononuclear cells were isolated from patient blood samples using immunomagnetic beads. For generating ECFCs, CD34+ cells were plated on fibronectin-coated dishes and were expanded by culture in endothelial-specific cell medium. Either human ECFCs (5×10^5) or control medium were injected into the peri-infarct region after surgical MI induction in SCID/beige mice. Hemodynamic function was assessed invasively 30 days post-MI. Hearts were analyzed immunohistochemically to assess cell fate, infarct size and neovascularization (ECFCs n=15 vs. control n=10). Flow-cytometric analysis of enzymatically digested whole heart tissue was used to analyze different subsets of migrated CD34+/CD45+ peripheral mononuclear cells as well as CD34-/CD45- cardiac resident stem cells 2 days post-MI (ECFCs n= 10 vs. control n=6). Results: Transplantation of human ECFCs after MI improved hemodynamic function at day 30 post-MI (EF: 30.43±1.20% vs. 22.61±1.73%, p<0.001; ΔP/ΔTmax 5202.28±316.68mmHg/sec vs. 3896.24±534.95mmHg/sec, p<0.05) when compared to controls. In addition, a significantly reduced infarct size (50.3±4.5% vs. 66.1±4.3%, p<0.05) was seen in ECFC treated animals compared to controls. Immunohistochemistry failed to show integration and survival of transplanted cells. However, anti-CD31 immunohistochemistry demonstrated an increased vascular density within the infarct border zone (8.6±0.4 per HPF vs. 6.2±0.5 per HPF, p<0.001). Flow cytometry at day 2 post-MI showed a trend towards increased myocardial homing of CD45+/CD34+ mononuclear cells (1.1±0.3% vs. 0.7±0.1%, p=0.2). Interestingly, we detected a significant increase in CD34-/CD45-/Sca1+ cardiac resident stem cells (11.7±1.7% vs. 4.7±1.7%, p<0.01). In a subgroup analysis no significant differences were seen in the effects of ECFCs derived from diabetic- or non-diabetic patients. Conclusions: In a murine MI model, transplantation of human ECFCs ameliorates myocardial function by attenuation of adverse post-MI remodeling, presumably mainly through paracrine effects. Cardiac repair is enhanced by increasing myocardial neovascularization and the pool of Sca1+ cardiac resident stem cells. The use of human ECFCs for treating ischemic heart disease warrants further investigation.