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Orozco Moisa, Denise Marie (2014): The role of Fused in Sarcoma (FUS) in the alternative splicing of TAU. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät
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Abstract

Neurodegenerative disease patients suffer from cognitive decline and/or motor dysfunctions, depending on the different regions affected by the neuron loss. With aging being the major risk factor and a society with increased life expectancy, there is an urgent need to develop new effective treatments to alleviate the situation faced by patients, their families and society. Although neurodegenerative diseases including Alzheimer’s disease (AD), amyotrophic lateral sclerosis (ALS) or frontotemporal dementia (FTD) lead to different clinical symptoms, they share common pathomechanisms, such as protein aggregation and altered RNA metabolism. A subset of ALS and FTD cases, for instance, is pathologically characterized by neuronal cytoplasmic inclusions containing aggregated Fused in Sarcoma (FUS) protein. There is also a genetic link, since FUS mutations cause ALS with FUS pathology. FUS is a DNA/RNA-binding protein known to regulate different steps of RNA metabolism, however, its exact function and target genes in neurons were unknown. In this study, I evaluated the neuronal role of FUS in alternative splicing using a candidate approach focusing on the microtubule-associated protein TAU. TAU is one of the most widely studied proteins in neurodegeneration research due to its aggregation in different tauopathies, most notably AD. Mutations in the TAU gene MAPT, that affect alternative splicing of exon 10, are known to cause another subtype of FTD. Here, I demonstrate that FUS depleted rat neurons, although having normal viability, show aberrant alternative splicing of TAU, with increased inclusion of exon 3 and exon 10, resulting in higher expression of the 2N and 4R TAU isoforms. Importantly, reintroduction of human FUS rescues aberrant splicing of TAU in FUS depleted neurons. Accordingly, overexpression of FUS decreases expression of 2N and 4R TAU isoforms. In mouse brain lysates, I detected direct FUS binding to TAU pre-mRNA, with strong binding around the regulated exon 10, often at AUU-rich RNA stretches. Since TAU splicing is regulated differently in humans and rodents, I also confirmed the role of human FUS in TAU exon 10 splicing using a TAU minigene and a human neuronal cell line. In addition, I analyzed the morphology and development of axons to evaluate the functional consequences of FUS depletion in neurons. Although FUS depleted neurons develop neurites normally, their axons are significantly shorter than in the control cells. Similar to observations in TAU/MAP1B knockout neurons, axons of FUS depleted neurons develop significantly larger growth cones with abnormal cytoskeletal organization. The development of growth cones in vivo is an essential step in axonal maintenance and repair. Altogether, this study identified TAU as the first physiological splice target of FUS in neurons. The newly discovered role of FUS in regulating the axonal cytoskeleton indicates that aberrant axonal function could contribute to the neuron loss seen in ALS/FTD cases with FUS aggregates.

Abstract

Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen können an kognitivem Abbau und/oder motorische Störungen leiden, je nachdem welche Gehirnregion von dem Verlust von Neuronen betroffen ist. Da sich das Risiko einer neurodegenerativen Erkrankung mit zunehmendem Alter drastisch erhöht und wir eine Gesellschaft mit steigender Lebenserwartung haben, ist es dringend notwending, neue wirksame Behandlungsmethoden zu entwickeln, um die Situation, mit der sich Patienten, ihre Familien und die Gesellschaft konfrontiert sehen, zu erleichtern. Obwohl sich verschiedene neurodegenerative Erkrankungen wie die Alzheimer-Erkrankung (AD), Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) oder Frontotemporale Demenz (FTD) klinisch unterscheiden, gibt es gemeinsame Pathomechanismen, wie Proteinaggregation und Störungen im RNA-Metabolismus. Bei einem Teil der ALS und FTD Patienten beobachtet man Ablagerungen aus aggregiertem Fused in Sarcoma (FUS) Protein. Des Weiteren verursachen FUS Mutationen ALS mit FUS neuronalen Aggregaten. FUS ist ein DNA/RNA-bindendes Protein, das verschiedene Schritte des RNA-Metabolismus reguliert. Die genaue Funktion von FUS und seine Zielgene in Neuronen waren jedoch bisher unbekannt. In dieser Studie habe ich die Funktion von FUS auf neuronales alternatives Spleißen mit einem Kandidaten-Ansatz untersucht, und mich insbesondere auf das Mikrotubuli-bindende Protein TAU fokussiert. Tau ist eines der bekanntesten Proteine in der Demenzforschung, da TAU Aggregate in verschiedenen sogenannten Tauopathien, insbesondere AD, gefunden wurden. Mutationen im TAU Gen MAPT, die das alternative Spleißen von TAU Exon 10 beeinflussen, können einen anderen Subtyp der FTD verursachen. Diese Studie zeigt, dass die Herunterregulierung (Gen-Knockdown) von FUS in murinen Neuronen das Überleben der Neuronen nicht beeinträchtigt, aber zu verändertem alternativen Spleißen von TAU mit einem erhöhten Einschluss von Exon 3 und Exon 10 führt und somit eine höhere Expression von den 2N und 4R TAU Isoformen verursacht. Eine wichtige Beobachtung dieser Studie war auch, dass die Expression von humanem FUS in FUS knockdown Neuronen aberrantes TAU Spleißen korrigieren kann. Dementsprechend führte auch die alleinige Überexpression von FUS zu einer verminderten Expression von 2N und 4R TAU. In Lysaten von Mausgehirnen konnte ich eine direkte Interaktion zwischen FUS und TAU RNA nachweisen, und zwar mit bevorzugter FUS Bindung nahe am regulierten TAU Exon 10 und oft an AUU-reichen RNA-Abschnitten. Da das Spleißen von TAU in Menschen und Nagetieren unterschiedlich reguliert wird, bestätigte ich mit sowohl einer menschlichen neuronalen Zelllinie als auch einem TAU-Minigen Konstrukt die Rolle von humanem FUS in TAU Exon 10 Spleißen. Um die funktionalen Konsequenzen von FUS knockdown in Neuronen zu bewerten, analysierte ich die Morphologie und Entwicklung der Axone. Obwohl Neuronen mit FUS knockdown normalen Neuriten bilden, sind ihre Axone deutlich kürzer als die der Kontroll-Neuronen. Wie auch schon in TAU/MAP1B knockout Neuronen beobachtet wurde, entwickeln FUS knockdown Neuronen Axone mit einem deutlich größeren Wachstumskegel und abnormer Zytoskelett-Organisation. Die dynamische Bildung axonaler Wachstumskegel ist ein wesentlicher Schritt in der axonalen Aufrechterhaltung und Reparatur in vivo. Insgesamt konnte diese Studie TAU als erstes physiologisches splice Zielgen von FUS in Neuronen identifizieren. Die neu entdeckte Funktion von FUS bei der Regulation des axonalen Zytoskelettes spricht für eine mögliche Rolle der veränderten axonalen Funktion beim Verlust von Neuronen in ALS/FTD Fällen mit FUS Aggregaten.