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Niedl, Anna (2014): Characterization of disease-related CD8+ T cells and their antigens from patients with Multiple Sclerosis. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät
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Abstract

Multiple Sclerosis is most probably an autoimmune inflammatory disease of the central nervous system. Demyelination of neurons and axonal loss occur in temporal and spatial resolution in multiple areas of the brain and spinal cord. This impairment manifests in neurological symptoms. The course of disease varies between individuals and the causing mechanisms still remain elusive. Environmental factors as well as genetic predispositions are widely discussed. Recent studies stressed the prominent role of CD8+ T lymphocytes in the autoimmune pathomechanism. They notably exceed the amount of CD4+ T cells in acute lesions yet target cells and activating antigens remain elusive. A genetic linkage between the human leukocyte antigen gene locus and disease susceptibility was observed. Carrying the HLA A*0301 allele or the HLA A*0201 allele correlates with a risk factor or protective effect for Multiple Sclerosis susceptibility, respectively. Thus during this thesis two main questions were followed: 1. Which CD8+ T lymphocytes participate in the autoimmune attack on central nervous system tissue and what are their receptors for antigen recognition? 2. How does the expression of HLA-A2 molecules lead to a decreased disease susceptibility? In the first part, the T cell receptor molecules of potentially disease-related single CD8+ T cells from frozen patient tissue samples were characterized. T lymphocytes were considered disease-related when they either belonged to a clonally expanded T cell population or expressed an activation marker on their cell surface. In a clone-specific approach, the T cell receptor beta chains of pre-analyzed, clonally expanded T cell populations were investigated. Further an unbiased approach independent of pre-analyses was established. In the second part, antigen recognition of the probably disease-related T cell receptor 2D1 was investigated. This receptor was isolated from a Multiple Sclerosis patient and was known to be activated by a myelin-derived peptide presented on HLA-A3 molecules. In an animal model double-transgenic mice expressing HLA-A3 and the 2D1 T cell receptor developed a Multiple Sclerosis-like disease after immunization with the known peptide. Surprisingly not a single triple-transgenic mouse expressing HLA-A3, the T cell receptor 2D1 and HLA-A2 showed symptoms after immunization. In these mice 2D1 T lymphocytes were shown to be depleted in the thymus. To characterize HLA-A2-bound peptides which mediate this protective effect a novel technology for unbiased identification of antigenic peptides recognized by human leukocyte antigen class I-restricted T lymphocytes was employed. 28 peptides presented on HLA-A2 molecules were found to be recognized by the T cell receptor 2D1. Those peptides displayed very closely related sequences. Eight possible parent proteins existing in mouse, therefrom even four equally expressed in humans were identified. Finally those putative parent proteins were further characterized and first investigations of antigen processing in different antigen presenting cell lines were performed.

Abstract

Multiple Sklerose ist wahrscheinlich eine autoimmunvermittelte, entzündliche Erkrankung des zentralen Nervensystems. An verschiedenen Stellen im Gehirn und Rückenmark kommt es zu einer Zerstörung der Markscheiden und Axone. Diese Schädigung führt zu neurologischen Symptomen. Der Krankheits-verlauf ist nicht vorhersehbar und zugrundeliegende Mechanismen sind weitgehend unbekannt. Sowohl Umwelteinflüsse als auch genetische Prädisposition werden in diesem Zusammenhang diskutiert. Vor kurzem wurde CD8+ T Lymphozyten eine entscheidende Rolle bei der autoimmunvermittelten Pathogenese zugesprochen. Sie übertreffen deutlich die Anzahl an CD4+ T Zellen in aktiven Läsionen aber Zielzellen oder erkannte Antigene sind bisher unbekannt. Schon sehr früh konnte eine genetische Verknüpfung zwischen der Wahrscheinlichkeit an Multipler Sklerose zu erkranken und dem humanen Leukozyten Antigen Genlocus festgestellt werden. Dabei wird das Risiko durch den Besitz des HLA A*0301 Allels erhöht und des HLA A*0201 Allels gesenkt. Demnach wurden in der vorliegenden Arbeit folgende zwei Fragestellungen bearbeitet: 1. Welche CD8+ T Lymphozyten sind an dem Autoimmunangriff auf das zentrale Nervensystem beteiligt und welche Rezeptoren tragen sie zur Antigenerkennung? 2. Wie vermindert die Expression von HLA-A2 Molekülen das Erkrankungsrisiko? Im ersten Teil wurden T Zell Rezeptoren von potentiell krankheitsrelevanten CD8+ Einzelzellen aus gefrorenem Patientengewebe charakterisiert. Krankheitsrelevanz wurde durch Zugehörigkeit zu einer klonal expandierten Zellpopulation oder durch die Expression von Aktivierungsmarkern definiert. In einem klonspezifischen Ansatz wurden die T Zell Rezeptor beta Ketten von voruntersuchten, klonal expandierten T Zell Populationen analysiert. Zudem wurde eine neue, von Voruntersuchungen unab-hängige Methode zur Charakterisierung von T Zell Rezeptor beta Ketten entwickelt. Im zweiten Teil wurde die Antigenerkennung des möglicherweise krankheitsrelevanten T Zell Rezeptors 2D1 untersucht. Dieser Rezeptor wurde aus einem Multiple Sklerose Patienten isoliert. Der T Zell Rezeptor 2D1 erkennt ein Peptid, welches aus der Myelinscheide stammt und auf HLA-A3 Molekülen präsentiert wird. In einem Mausmodell entwickelten doppelt transgene Mäuse, die HLA-A3 und den T Zell Rezeptor 2D1 exprimierten, der Multiplen Sklerose ähnliche Symptome nach Immunisierung mit dem Myelinpeptid. Dreifach transgene Mäuse hingegen, die HLA-A3, den T Zell Rezeptor 2D1 und HLA-A2 exprimierten, blieben gesund. Die 2D1 T Zellen wurden in diesen Mäusen bereits im Thymus deletiert. Um herauszufinden, welche HLA-A2 gebundenen Peptide diesen schützenden Effekt vermitteln, wurde eine neu entwickelte Methode angewandt, mit welcher Antigene von HLA Klasse I restringierten T Zellen identifiziert werden können. Dabei wurden 28 Peptide isoliert, welche von dem T Zell Rezeptor 2D1 auf HLA-A2 Molekülen erkannt werden. Diese Peptide wiesen hohe Sequenzähnlichkeiten auf. Acht Proteine aus der Maus – davon vier auch im Menschen vorhanden – kamen als Quellprotein in Frage. Schließlich wurden diese acht Proteine näher analysiert und Versuche zur Antigenprozessierung in unterschiedlichen antigenpräsentierenden Zellen durchgeführt.