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Mayer, Marie Cathrin (2014): Identification and temporal stability of conformational epitopes of autoantibodies against Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein recognized by patients with different inflammatory central nervous system diseases. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät
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Abstract

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG) is one of the few proteins known to be localized on the outermost sheath of central nervous system (CNS) myelin. Due to this localization, MOG is accessible to antibodies. Anti-MOG antibodies are demyelinating and enhance clinical symptoms in a number of animal models of CNS inflammation. Autoantibodies recognizing conformationally intact MOG are found in different inflammatory diseases of the CNS, but their antigenic epitopes had not been mapped. In this work, 9 variants of MOG with an intracellular enhanced green fluorescent protein (EGFP) tag were expressed on the cell surface of human HeLa cells and used to analyze sera from 111 patients (104 children, 7 adults), who had antibodies recognizing cell-bound human MOG. These patients had different diseases, namely acute disseminated encephalomyelitis (ADEM), one episode of transverse myelitis or optic neuritis, multiple sclerosis (MS), anti-aquaporin-4 (AQP4)–negative neuromyelitis optica (NMO), and chronic relapsing inflammatory optic neuritis (CRION). The expression levels of the mutants were comparable and cells with a defined expression level (fluorescence intensity in the EGFP channel of 102-103) were gated. Each MOG-mutant was recognized by at least one MOG-specific mAb. This allowed the comparison of binding to the different mutants. In order to assess the reproducibility of the system, binding of the 111 sera to the mutants was analyzed up to three times in independent experiments, yielding a very good reproducibility of the binding percentage with an absolute SD of 7.8% in the case of low recognition of a mutant and a relative SD of 20% in the case of high recognition of a mutant. The applied variants of MOG gave insight into epitope recognition of 98 patients. All epitopes identified in this work were located at loops connecting the ß-strands of MOG. The immunodominant epitope of human anti-MOG antibodies was at the membrane-proximal CC’-loop containing aa42, which is not present in rodent MOG. This loop was recognized by about half of all patients. Overall, seven epitope patterns were distinguished, including the one mainly recognized by mouse mAbs at the FG-loop around aa104. Evidence from mouse models of CNS inflammation shows that anti-MOG antibodies recognizing different epitopes can be demyelinating and thus pathogenic. This suggests that not only those antibodies recognizing the same epitope of MOG as the pathogenic mAbs (i.e. the FG-loop), but also the ones recognizing the CC'-loop are pathogenic in humans, as both epitopes allow for the recognition of cell-bound MOG. In half of the patients, the anti-MOG response was directed to a single epitope. To analyze the effect of glycosylation on the recognition of MOG by human autoantibodies, a “non-glycosylation mutant” N31D was made. Digestion with PNGaseF and Western blot analysis confirmed that N31 was the only used N-glycosylation site of the MOG constructs in HeLa cells. Glycosylation of MOG was not needed for antibody binding, but 8% of the patients recognized deglycosylated MOG at least two-fold better. The epitope specificity was not linked to certain disease entities. The individual epitope recognition patterns stayed constant in 11 analyzed patients over an observation period of up to 5 years without evidence for intramolecular epitope spreading. Some patients with acute syndromes had anti-MOG IgG at disease onset, but rapidly lost their anti-MOG IgG reactivity. These patients were able to generate a long-lasting IgG response to measles and rubella virus vaccine indicating that the loss of anti-MOG reactivity was not reflective of a lack of capacity for longstanding IgG responses. Human anti-MOG antibodies are mainly of the IgG1 isotype, which can activate complement and antibody dependent cellular cytotoxicity. Upon binding to MOG in the CNS, human anti-MOG antibodies are hence expected to cause demyelination. Transfer experiments with purified human anti-MOG antibodies have not been performed yet. The fact that the majority of human anti-MOG antibodies did not recognize rodent MOG has implications for animal studies. Using the described assay will help to identify patient samples appropriate for these transfer experiments and finally lead to the formal proof of the pathogenicity of human anti-MOG antibodies. This work also gives important information for future detection of potential mimotopes and the development of anti-MOG antibody detection assays and might pave the way to antigen-specific depletion.

Abstract

Das Myelin Oligodendrozyten Glykoprotein (MOG) ist eines der wenigen Proteine, von denen bekannt ist, dass sie sich auf der äußersten Schicht der Myelinscheide im zentralen Nervensystem (ZNS) befinden. Aufgrund dieser Lokalisation ist MOG für Antikörper erreichbar. Antikörper gegen MOG wirken in Tiermodellen demyelinisierend und verstärken dort die klinischen Symptome. Antikörper gegen konformationelles MOG werden in unterschiedlichen entzündlichen Erkrankungen des ZNS gefunden, aber ihre antigenen Epitope wurden bisher nicht bestimmt. In dieser Arbeit wurden 9 MOG-Varianten mit intrazellulärer EGFP-Markierung auf der Zelloberfläche von HeLa-Zellen exprimiert und verwendet, um Seren von 111 Patienten (104 Kindern, 7 Erwachsenen) mit Antikörpern gegen zellgebundenes MOG zu untersuchen. Diese Patienten hatten unterschiedliche Krankheiten, namentlich akute disseminierte Enzephalomyelitis (ADEM), ein Ereignis einer transversen Myelitis oder Sehnerventzündung, Multiple Sklerose (MS), anti-Aquaporin-4 negative Neuromyelitis optica (NMO) und chronisch wiederkehrende Sehnerventzündung (CRION). Der Expressionslevel der Mutanten war vergleichbar und es wurden Zellen mit einem definierten Expressionslevel (Fluoreszenzintensität im EGFP Kanal von 102-103) ausgewählt. Jede MOG Variante wurde von mindestens einem monoklonalen Antikörper erkannt. Somit konnte die Erkennung einzelner Mutanten untereinander verglichen werden. Um die Reproduzierbarkeit dieses Systems zu überprüfen, wurde die Bindung der 111 Seren zu den Mutanten bis zu dreimal in unabhängigen Experimenten gemessen. Die Ergebnisse waren sehr gut reproduzierbar, mit einer absoluten Standardabweichung von 7.8% bei geringer Erkennung einer Mutante und einer relativen Standardabweichung von 20% im Falle guter Erkennung einer Mutante. Die eingesetzten MOG Varianten gaben Einblick in die Epitoperkennung von 98 Patienten. Alle in dieser Arbeit identifizierten Epitope befinden sich in den Schlaufen, die die ß-Stränge von MOG miteinander verbinden. Das immundominante Epitop humaner anti-MOG Antikörper lag an der membrannahen CC'-Schlaufe, die die Aminosäure 42 enthält, welche in Maus-MOG nicht vorhanden ist. Diese Schlaufe wurde von ungefähr der Hälfte der Patienten erkannt. Zusammen wurden sieben Epitop-Erkennungsmuster unterschieden, inklusive jenem um die FG-Schlaufe mit Aminosäure 104, welches hauptsächlich von monoklonalen Maus Antikörpern erkannt wird. In ungefähr der Hälfte der Patienten war die anti-MOG Antwort gegen ein einzelnes Epitop gerichtet. Um zu untersuchen, welche Rolle die Glykosylierung in der Erkennung von MOG durch humane Antikörper hat, wurde die “Nicht-Glykosylierungs-Mutante” N31D hergestellt. Verdau mit PNGase F und Western blot Analyse bestätigten, dass N31 die einzige verwendete N-Glykosylierungsstelle der MOG Konstrukte in HeLa Zellen war. Glykosylierung war für die Antikörperbindung nicht nötig, aber 8% der Patienten erkannten nicht glykosyliertes MOG mindestens doppelt so gut. Es gab keine Verbindung zwischen Epitoperkennung und einer bestimmten Krankheit. Die individuellen Epitop-Erkennungsmuster blieben unverändert in 11 untersuchten Patienten über einen Beobachtungszeitraum von 5 Jahren, ohne dass es Hinweise auf intramolekulare Epitop-Ausweitungen gab. Einige Patienten mit akuten Erkrankungen hatten anti-MOG Antikörper in der akuten Phase ihrer Krankheit, aber verloren diese rasch. Diese Patienten konnten dennoch eine nachhaltige IgG Antwort zu einer Masern- und Rötelnviren Impfung bilden. Dies zeigt, dass der Verlust der anti-MOG Antwort nicht auf eine generelle Unfähigkeit, nachhaltige IgG Antworten zu bilden, zurückzuführen ist. Menschliche anti-MOG Antikörper haben hauptsächlich den IgG1 Isotyp, der Komplement aktivieren und Antikörper-abhängige zelluläre Toxizität auslösen kann. Es wird erwartet, dass anti-MOG Antikörper, wenn sie MOG im ZNS binden, zu Demyelinisierung führen. Transferexperimente mit aufgereinigten MOG-Antikörpern wurden bisher nicht durchgeführt. Die Tatsache, dass die Mehrheit der menschlichen anti-MOG Antikörper Maus-MOG nicht erkannt haben, hat Konsequenzen für Tierstudien. Durch den Einsatz des hier beschriebenen Verfahrens können Patientenproben identifiziert werden, die sich für diese Transferexperimente eignen und dies wird letztlich dazu führen, dass die Pathogenität von MOG-Antikörpern formal bewiesen wird. Diese Arbeit liefert darüber hinaus wichtige Informationen für die spätere Ermittlung potenzieller Mimotope und die Entwicklung von anti-MOG Antikörper-Assays und könnte den Weg zu einer Antigen-spezifischen Depletion ebnen.