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Schick, Julia (2014): Prädiktive Relevanz regulatorischer T-Zellsubpopulationen nach Stimulation mit dendritischen Zellen leukämischer Abstammung für die antileukämische T-Zellantwort. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät
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Abstract

Regulatory T-cells (Treg) are important regulators of immune responses. In AML patients before/after immunotherapy (stem-cell-transplantation (SZT) or donor-lymphocyte-infusion (DLI)) their suppressive role can contribute to suppress severe graft-versus-host-reactions (GVHD), but also to impair antileukemic reactions. Aim: Since leukemia-derived dendritic-cells (DCleu) are known to improve antileukemic functionality of T-cells we evaluated the composition and development of distinct Treg-subtypes in AML-pts (n=12) compared to healthy probands (n=5) under unstimulated conditions and during stimulation with DCleu-containing DC (‘DC’) or blast-containing mononuclear cells (‘MNC’) in 0-7 days mixed lymphocyte cultures (MLC) by flowcytometry. T-cell-subgroups in AML pts were correlated with antileukemic functionality before and after ‘DC’ or ’MNC’ stimulation by functional fluorolysis-assays. Results: 1. AML-pts’ T-cells presented with significantly higher frequencies of Treg-subgroups in unstimulated T-cells compared to healthy probands. 2. After 7 days of ‘DC’ or ‘MNC’-stimulation all Treg-subtypes generally increased; significantly higher frequencies of Treg-subtypes were still found in AML-pts. 3. Antileukemic cytotoxicity was achieved in 36% of T-cells after ‘MNC’- compared to 64% after ‘DC’-stimulation. Antileukemic activity after ‘DC’ but not after ‘MNC’-stimulation correlated with significantly lower frequencies of Treg-subtypes (CD8+ Treg/Teff/em reg). Furthermore, cut-off-values for Treg subpopulations could be defined allowing a prediction of antileukemic response. Conclusion: We demonstrate a crucial role of special Treg-subtypes in the mediation of antileukemic functionality. High CD8+Treg, Teff/em reg and CD39+T-Zellen clearly correlated with reduced antileukemic activity of T-cells. ‘DC’ stimulation of T-cells contributes to overcome impaired antileukemic T-cell-reactivity. Refined analyses in the context of clinical responses to immunotherapy and GVHD reactions are required.

Abstract

Regulatorische T-Zellen (Treg) sind wichtige Regulatoren von Immunantworten. Bei Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML), welche vor oder nach einer Stammzelltransplantation (SZT) oder Erhalt von Donor-Lymphozyten-Infusionen (DLI) stehen, können Treg einerseits dazu beitragen schwere Graft-versus-Host- Reaktionen (GVHD) zu unterdrücken, andererseits können sie jedoch die gewünschte antileukämische Antwort mindern. Dendritische Zellen sind als antigenpräsentierende Zellen in der Lage, T-Zellen und somit Immunantworten zu stimulieren. Es ist bekannt, dass dendritische Zellen aus leukämischen Blasten (DCleu) generiert werden können und diese DCleu die antileukämische T-Zellantwort verbessern [1]. Unklar in diesem Zusammenhang, und somit Ziel dieser Arbeit, ist die genaue Zusammensetzung und kinetische Entwicklung von verschiedenen Treg Untergruppen bei AML Patienten unter Stimulation mit DCleu. Hierzu wurden die Treg Untergruppen von 12 AML Patienten mit 5 gesunden Probanden unter unstimulierten Bedingungen und während der siebentägigen Stimulation verglichen. Die T-Zell-Stimulation wurde einerseits mit dendritischen Zellen, welche DCleu enthielten, andererseits mit mononukleären Zellen, welche bei den AML Patienten auch leukämischen Blasten enthielten, in einer gemischten Lymphozyten Kultur (MLC) durchgeführt. Die T-Zell-Analysen erfolgten mittels Durchflusszytometrie. Zuletzt wurde bei den AML Patienten die antileukämische T-Zell-Funktionalität mit unstimulierten sowie ‚DC‘- oder ‚MNC‘- stimulierten Bedingungen anhand eines funktionellen Fluorolyse Zytotoxizitätsassay korreliert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten, dass AML Patienten unter unstimulierten Bedingungen signifikant höhere Anteile von Treg Untergruppen aufwiesen als die gesunden Probanden. Nach der siebentägigen Stimulation mit ‚DC‘ oder ‚MNC‘ konnte ein genereller Anstieg der verschiedenen Treg Untergruppen nachgewiesen werden. AML Patienten zeigten auch nach Zusammenfassung 3 Stimulation weiterhin signifikant höhere Anteile an Treg als die gesunden Probanden. Eine antileukämische, zytotoxische T-Zell-Antwort wurde bei 36% der Patienten nach ‚MNC‘ Stimulation sowie bei 64% nach ‚DC‘ Stimulation erreicht. Die antileukämische Aktivität korrelierte nach ‚DC‘ Stimulation, jedoch nicht nach ‚MNC‘ Stimulation mit signifikant niedrigeren Anteile an Treg Untergruppen, insbesondere der CD8+ Treg und der Teff/em reg. Des Weiteren konnten erstmalig Cut-off-Werte für die Treg Untergruppen definiert werden, welche eine prädiktive Aussage über die antileukämische T-Zellantwort zulassen. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit die wichtige Rolle einzelner Treg Untergruppen bei der Vermittlung spezifischer antileukämischer T-Zell-Antworten. Hohe Anteile an CD8+ Treg oder Teff/em reg oder CD39+ T-Zellen korrelieren mit einer verminderten antileukämischen T-Zell-Aktivität. Die T-Zell-Stimulation mit DCleu kann bei AML Patienten dazu beitragen, die verminderte antileukämische T-Zell-Aktivität zu verbessern.