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Hondele, Maria (2013): An integrated view of the essential eukaryotic chaperone FACT in complex with histones H2A-H2B. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät
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Abstract

Summary: Structure of the FACT chaperone domain in complex with histones H2A-H2B, and a model for FACT-mediated nucleosome reorganization Nucleosomes are the smalles unit of chromatin: two coils of DNA are wrapped around a histone octamer core, which neutralizes its charge and `packs' the lengthy molecule. Nucleosomes confer a barrier to processes that require access to the eukaryotic genome such as transcription, DNA replication and repair. A variety of nucleosome remodeling machines and histone chaperones facilitate nucleosome dynamics by depositing or evicting histones and unwrapping the DNA. The eukaryotic FACT complex (composed of the subunits Spt16 and Pob3) is an essential and highly conserved chaperone. It assists the progression of DNA and RNA polymerases, for example by facilitating transcriptional initiation and elongation. Further, it promotes the genome-wide integrity of chromatin structure, including the suppression of cryptic transcription. Genetic and biochemical assays have shown that FACT's chaperone activity is crucially mediated by a direct interaction with histones H2A-H2B. However, the structural basis for how H2A-H2B are recognized and how this integrates with FACT’s other functions, including the recognition of histones H3-H4 and of other nuclear factors, is unknown. In my PhD research project, I was able to reveal the structure of the yeast chaperone domain in complex with the H2A-H2B heterodimer and show that the Spt16M module in FACT’s Spt16 subunit establishes the evolutionarily conserved H2A-H2B binding and chaperoning function. The structure shows how an alpha-helical `U-turn' motif in Spt16M interacts with the alpha-1-helix of H2B. The U-turn motif scaffolds onto a tandem pleckstrin-homology-like (PHL) module, which is structurally and functionally related to the H3-H4 chaperone Rtt106 and the Pob3M domain of FACT. Biochemical and in vivo assays validate the crystal structure and dissect the contribution of histone tails and H3-H4 toward FACT binding. My results show that Spt16M makes multiple interactions with histones, which I suggest allow the module to gradually invade the nucleosome and ultimately block the strongest interaction surface of H2B with nucleosomal DNA by binding the H2B alpha-1-helix. Together, these multiple contact points establish an extended surface that could reorganize the first 30 base-pairs of nucleosomal histone–DNA contacts. Further, I report a brief biochemical analysis of FACT’s heterodimerization domain. Its PHL fold indicates shared evolutionary origin with the H3-H4-binding Spt16M, Pob3M and Rtt106 tandem PHL modules. However, the Spt16D–Pob3N heterodimer does not bind histones, rather it connects FACT to replicative DNA polymerases. The snapshots of FACT’s engagement with H2A-H2B and structure-function analysis of all its domains lay the foundation for the systematic analysis of FACT’s vital chaperoning functions and how the complex promotes the activity of enzymes that require nucleosome reorganization.

Abstract

Zusammenfassung: Struktur der FACT Chaperon-Domäne im Komplex mit Histonen H2A-H2B, und ein Modell für die FACT-vermittelte Restrukturierung des Nukleosoms Nukleosomen sind die kleinsten Bausteine des Chromatin: das DNA Molekül wickelt sich in zwei Windungen um einen Oktamer aus Histon-Proteinen, die seine Ladung neutralisieren und es ordentlich `verpacken'. Deshalb sind Nukleosomen ein Hindernis für alle nukleären Prozesse, die Zugang zur DNA erfordern, wie zum Beispiel Transkription, Replikation oder Reparatur der DNA. Verschiedene Protein-Komplexe (ATP-abhängige `Remodeler' und ATP-unabhängige Histon-Chaperone) halten Nukleosomen in einem dynamischen und zugänglichen Zustand, indem sie Histone aus- oder ein-bauen, oder die DNA vom Oktamer abwickeln. Der eukaryotische FACT Komplex ist ein hochkonserviertes, heterodimeres Histon-Chaperon (aus den Unterheiten Spt16 und Pob3), das DNA und RNA Polymerasen unterstützt, durch Nukleosomen hindurchzuschreiben. Gleichzeitig stellt es sicher, dass die Chromatin-Integrität erhalten bleibt und unterdrückt dadurch z.B. Transkription von sogenannten kryptischen Promotoren. Genetische und biochemische Experimente haben gezeigt, dass die Interaktion mit Histonen, vor allem mit dem H2A-H2B Histon-Dimer, entscheidend für die Funktionalität von FACT als Histon Chaperon ist. Es fehlten jedoch molekulare oder strukturelle Informationen wie die Histone gebunden werden und wie dies mit den anderen biologischen Funktionen von FACT zusammenspielt, wie zum Beispiel der Interaktion mit Histonen H3-H4 oder anderen nukleären Faktoren, und letztendlich wie das reorganisierte Nukleosom aussehen könnte. In dieser Arbeit habe ich die H2A-H2B bindende Domäne von FACT, Spt16M, identifiziert und ihre Struktur im Komplex mit H2A-H2B gelöst. Die H2A-H2B Bindung habe ich biochemisch verifiziert, verfeinert und den Phänotyp von wichtigen Spt16M-Aminosäuren in vivo in Hefe analysiert. Ein strukturell und funktionell konserviertes, neuartiges `U-turn' (Kehrtwende) Motif interagiert mit der alpha-1-Helix des globulären Kerns von Histon H2B; diese hydrophobe Interaktion mit mikromolarer Affnität ist essentiell für die Komplex-Stabilität. Ein konservierter `acidic patch' (`negativ geladene Partie') interagiert zusätzlich mit dem unstrukturierten N-terminalen Ende von H2B und stabilisiert dadurch den Komplex kinetisch. Das Spt16M U-turn Motif ist auf ein Tandem-PHL (pleckstrin-homology like) Modul aufgebaut, das hohe strukturelle Verwandtschaft zu den Histon-Chaperonen Rtt106 und Pob3M aufweist. Wie Rtt106 und Pob3M bindet auch Spt16M Histone H3-H4. Die Interaktion wurde biochemisch auf die alpha-N-Helix von H3 eingegrenzt. Zusammenfassend bindet Spt16M an drei Stellen auf der Histon-Oktamer Oberfläche des Nukleosoms. Diese bilden eine zusammenhängende Fläche, welche die ersten 30 Basenpaare der nukleosomalen DNA koordiniert. Vermutlich erfolgt die Interaktion von Spt16M mit dem Nukleosom schrittweise: Zunächst bindet Spt16M über das frei zugänglichen N-terminale Ende von H2B an das Nukleosom. Dort `verharrt' das Chaperon bis die beiden stärkeren Interaktions-Stellen (die alpha-N Helix von H3 und die alpha-1 Helix von H2B), welche meist von DNA bedeckt sind, durch spontanes Ablösen der DNA freigelegt werden. Letztendlich würde die vollständige Bindung von FACT an das Nukleosom die ersten 30 Basenpaare DNA verdrängen und dadurch das Nukleosom destablisieren, so dass andere nukläere Prozesse (z.B. Polymerasen) auf die DNA Stränge zugreifen können. Des Weiteren habe ich die Heterodimerisierungs-Domäne von FACT biochemisch analysiert. Spt16D-Pob3N besteht ebenfalls aus PHL Domänen, diese können jedoch keine Histone binden. Stattdessen koppeln sie den Chaperon-Komplex an die DNA Replikations-Maschinerie. Die vorgestellten Ergebnisse legen den Grundstein für strukturelle und mechanistische Studien wie der holo-FACT Komplex mit dem Nukleosom interagiert, und wie sich dies in den Replikations- und Transkriptions-Prozess eingliedert.