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Chen, Dong (2014): Identification of new prognostic markers in renal cell carcinoma. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät
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Abstract

The clinical course of renal cell carcinoma (RCC) shows a high variability. Prognostic markers are essential to enable an individualized therapeutic strategy. The objective of this study was the identification of novel independent prognostic markers and potential therapeutic targets in RCC. The focus was on genes involved in epithelial-mesenchymal transition (EMT) and cancer stem cell biology. EMT enhances tumor cell motility and hence plays a critical role in invasion and metastasis in various carcinomas. A set of transcription factors acts as master regulators of EMT. Whether EMT is important for tumor progression in clear cell renal cell carcinoma (RCC) is unknown. Therefore, EMT-related genes were selected from the literature, and their role and prognostic relevance in RCC were analyzed. The known cancer stem cell marker CXCR4 and the associated TPBG gene were also analyzed in this project. Additionally, a novel filter strategy was used to analyze RCC oligonucleotide microarray data for identification of potential prognostic markers: genes with increasing expression during tumor progression (normal kidney < primary tumor < metastases) were selected for outcome analysis because they could be crucial for RCC biology. Expression of 46 EMT-related genes was analyzed using oligonucleotide microarrays and gene set enrichment analysis (GSEA) in tissue samples from normal kidney and G1 and G3 primary RCC, 14 samples each. Expression of selected EMT genes was validated by real-time polymerase chain reaction (PCR) in normal kidney, primary RCC and metastases in an independent cohort of 112 patients and then combined with follow-up data for survival analysis. Immunohistochemistry, Western blot and flow cytometry were performed to further examine the expression of CXCR4 and co-expression of CXCR4 and TPBG on the surface of RCC cells. GSEA and dChip software were used for microarray data analysis. The EMT gene set was preferentially expressed in primary tumors compared to normal tissue (false discovery rate FDR=0.01), but no difference between G1 and G3 tumors was found. Quantitative RT-PCR showed down-regulation of critical EMT genes like CDH2 and ZEB1 in metastases which suggests reversal of EMT during metastasis. Kaplan-Meier analysis demonstrated a significant better outcome for patients with low CXCR4, vimentin, fibronectin and TWIST1 mRNA levels. Multivariate analysis revealed that CXCR4 and vimentin up-regulation represent independent prognostic markers for poor cancer-specific survival of RCC patients. The microarray approach using filtering and further RT-PCR validation of progression-associated genes revealed that ATAD2, TET3, HELLS and TOP2A are independent and previously unknown predictors of poor outcome in RCC patients. Taken together, this study provides strong evidence that EMT occurs in RCC. Modulation of EMT in RCC, therefore, might represent a future therapeutic option. Expression levels of a number of EMT-related genes (like the genes encoding the cancer stem cell marker CXCR4 and vimentin) could be identified as independent prognostic markers. Using a novel filtering approach on array data, additional novel prognostic markers could be identified. These findings contribute to a better risk stratification of RCC patients that can support an individualized and optimized therapeutic strategy.

Abstract

Der klinische Verlauf des Nierenzellkarzinoms (RCC) zeigt eine hohe Variabilität. Prognostische Marker sind unerlässlich, um eine individuelle Therapiestrategie zu ermöglichen. Das Ziel dieser Studie war die Identifizierung neuer unabhängiger prognostischer Marker und potentieller therapeutischer Targets beim RCC. Der Schwerpunkt lag auf Genen, die bei der Epithelial-Mesenchymalen Transition (EMT) und Tumorstammzellenbiologie beteiligt sind. EMT steigert die Beweglichkeit von Tumorzellen und spielt eine entscheidende Rolle bei der Invasion und Metastasierung bei verschiedenen Karzinomen. Eine Reihe von Transkriptionsfaktoren fungiert als die Hauptregulatoren von EMT. Ob EMT wichtig ist für die Tumorprogression beim klarzelligen Nierenzellkarzinom (RCC), ist unbekannt. Daher wurden EMT-Gene aus der Literatur ausgewählt und ihre Rolle und prognostische Relevanz bei RCC wurden analysiert. Der bekannte Tumorstammzellmarker CXCR4 und das damit assoziierte TPBG-Gen wurden auch in diesem Projekt analysiert. Zusätzlich wurde eine neuartige Filter-Strategie bei RCC-Microarray-Daten verwendet, um mögliche prognostische Marker zu identifizieren: Gene mit zunehmender Expression während der Tumorprogression (normale Niere < Primärtumor < Metastasen) wurden für die Outcome-Analyse ausgewählt, weil sie entscheidend für die RCC-Biologie sein könnten. Die Expression von 46 EMT-Genen wurde mit Oligonukleotid-Microarrays und Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) an Gewebeproben von normaler Niere und G1 und G3 Primärtumoren (jeweils 14 Proben) analysiert. Die Expression von ausgewählten EMT-Genen wurde mittels RT-PCR in normaler Niere, primärem RCC und Metastasen an einer unabhängigen Kohorte von 112 Patienten validiert und dann mit Follow-up-Daten für die Survivalanalyse kombiniert. Immunhistochemie, Western Blot und Durchflusszytometrie wurden durchgeführt, um die Expression von CXCR4 und die Co-Expression von CXCR4 und TPBG auf der Oberfläche von RCC-Zellen weiter zu untersuchen. Die Software GSEA und dChip wurde für die Analyse der Microarray-Daten verwendet. Das EMT-gene set wurde bevorzugt in Primärtumoren exprimiert, verglichen mit dem Normalgewebe (false discovery rate FDR = 0,01), es wurde aber kein Unterschied zwischen G1- und G3-Tumoren gefunden. Quantitative RT-PCR zeigte Herunterregulation von kritischen EMT-Genen wie CDH2 und ZEB1 in Metastasen, was eine Umkehrung der EMT während der Metastasierung vermuten lässt. Die Kaplan-Meier-Analyse zeigte signifikant bessere Ergebnisse für die Patienten mit niedriger CXCR4, Vimentin, Fibronectin und TWIST1 mRNA Expression. Die multivariate Analyse zeigte, dass eine Hochregulierung von CXCR4 und Vimentin unabhängige prognostischer Marker darstellen für ein schlechtes tumorspezifisches Überleben von RCC-Patienten. Der Microarray-Ansatz mit Filtern und weiterer RT-PCR-Validierung der Progressions-assoziierten Gene ergab, dass ATAD2, TET3, HELLS und TOP2A unabhängige und bisher unbekannte Prädiktoren für schlechtes Outcome bei RCC-Patienten sind. Insgesamt liefert diese Studie deutliche Hinweise, dass EMT bei RCC vorkommt. Die Modulation von EMT bei RCC könnte daher eine zukünftige therapeutische Option darstellen. Die Expressionsstärke einiger EMT-Gene (z.B. die Gene für den Tumorstammzellmarker CXCR4 und Vimentin) konnten als unabhängige prognostische Marker identifiziert werden. Mit Hilfe eines neuartigen Filter-Ansatzes bei Array-Daten konnten zusätzliche neue prognostische Marker identifiziert werden. Diese Ergebnisse tragen bei zu einer besseren Risikostratifizierung von RCC-Patienten, was eine individualisierte und optimierte Therapiestrategie unterstützen kann.