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Jain, Utkarsh (2014): Effects of Helicobacter pylori Vacuolating Cytotoxin A on intracellular calcium signalling in T-lymphocytes. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät
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Abstract

More than 50% of the world's population harbor Helicobacter pylori in their stomach mucosa. The chronic gastric infection is associated with several diseases including peptic ulcer disease and gastric carcinoma. One of the most thoroughly studied virulence factors produced by H. pylori is the Vacuolating Cytotoxin A (VacA). All isolated H. pylori strains possess the vacA gene, although significant sequence diversity was noticed in vacA genes across H. pylori isolates. VacA protein is produced and secreted as an 88 kD mature toxin. The protein binds to the host cells and is internalized. Inside the host cells, it causes “vacuole”-like membrane vesicles in the cytoplasm of gastric epithelial cells. Besides vacuolation, VacA exerts various other effects on target cells. VacA also forms membrane-embedded pores at the inner-mitochondrial membrane, resulting in mitochondrial dysfunction by cytochrome c release and apoptosis induction. VacA suppresses nuclear translocation of nuclear factor of activated T-cells (NFAT) resulting in down regulation of interleukin-2 (IL2) gene transcription to efficiently block proliferation of T-cells. The aim of this work was to understand the effects of VacA on intracellular calcium signalling in T-lymphocytes by considering the fact that VacA inhibits the Ca2+-calmodulin-dependent phosphatase calcineurin and induces cell cycle arrest. However, the exact mechanism how VacA exerts this response in T-cells is not known. Therefore, in this thesis various cell lines were used to study the effects of VacA on calcium influx. Calcium influx was found to be affected in the presence of VacA protein in the human Jurkat E6.1 T-cell line and primary human CD4+ T-cells activated by phorbol myristate acetate (PMA). Once inside T-cells, it could be shown that VacA suppresses the increase of the cytosolic free calcium concentration after stimulation by the calcium ionophore ionomycin and thapsigargin. Ionomycin forms pores in the cytoplasmic membrane, whereas thapsigargin blocks the sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) and thereby causes depletion of the endoplasmic reticulum (ER) calcium store. In contrast, a VacA mutant, which was constructed by deletion of the hydrophobic region (amino acids 6-27), was unable to induce vacuolation activity and to block Ca2+ influx. A major result of this work was to demonstrate that one of the main components of store operated calcium entry (SOCE), the ER localized calcium sensor protein STIM1, is a target of VacA. Using co-localization studies and yeast two-hybrid (YTH) assays, it was found that VacA localizes to the lumen of the ER where it binds to the cEF-hand domain of STIM1. Furthermore, these data show that VacA strongly reduced the movements of the STIM1 towards the plasma membrane localized calcium channel ORAI1 after Ca2+ store depletion by thapsigargin. A YTH screen identified cEF-hand domain of STIM1 as the target of VacA to inhibit calcium influx. The results obtained in this work showing involvement of VacA in the modulation of intracellular calcium signalling will provide new insights that are required to understand how VacA inhibits T-cell proliferation and signalling.

Abstract

Mehr als 50% der Weltbevölkerung tragen Helicobacter pylori in ihrem Magenepithel. H. pylori kolonisiert dauerhaft die Magenschleimhaut und ist mit verschiedenen Erkrankungen wie Magen- oder Zwölffingerdarmgeschwüren sowie Magenkrebs assoziiert. Einer der am besten untersuchten Virulenzfaktoren von H. pylori ist das vakuolisierende Cytotoxin VacA. Alle H. pylori-Isolate haben ein vacA-Gen, wobei allerdings deutliche Sequenzvariationen zwischen verschiedenen Stämmen auftreten. Das VacA-Protein wird als Vorläuferprotein produziert und als reifes Toxin von 88 kDa sekretiert. Das reife Protein bindet an Wirtszellen und wird von diesen internalisiert. In der Zielzelle verursacht es die Bildung vakuolenartiger Membranvesikel im Zytoplasma. Unabhängig von dieser Vakuolisierung hat VacA verschiedene weitere Effekte auf Zielzellen. So bildet es Poren in der inneren Mitochondrienmembran, die zu einer Mitochondrien-Fehlfunktion mit Cytochrom c-Freisetzung und Apoptose-Induktion führen. VacA unterdrückt auch die Translokation des Transkriptionsfaktors NFAT (Nuclear Factor of Activated T-cells) in den Zellkern und damit die Transkription des Interleukin-2 (IL-2)-Gens, was zu einer effizienten Hemmung der T-Zell-Proliferation führt. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung des Einflusses von VacA auf die intrazelluläre Calcium-Signalübertragung in T-Zellen vor dem Hintergrund, dass VacA die Calcium/Calmodulin-abhängige Phosphatase Calcineurin inhibiert und einen Stopp des Zellzyklus induziert. Der genaue Mechanismus dieser Antwort in T-Zellen ist allerdings nicht bekannt. In dieser Arbeit wurden verschiedene Zelllinien zur Untersuchung des Effekts von VacA auf den Calciumeinstrom verwendet. Es konnte nachgewiesen werden, dass der Calciumeinstrom in der humanen T-Zelllinie Jurkat E6.1 und in primären humanen CD4+ T-Zellen nach Aktivierung mit Phorbol-Myristat-Acetat (PMA) durch VacA beeinträchtigt wird. VacA supprimiert auch den Anstieg der freien Calcium-Konzentration im Cytosol nach Stimulierung mit den Calcium-Ionophoren Ionomycin und Thapsigargin. Ionomycin bildet Poren in der Cytoplasmamembran, während Thapsigargin die ATPase SERCA (sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase) blockiert und dadurch eine Calcium-Depletion im endoplasmatischen Reticulum (ER) verursacht. Im Gegensatz zu VacA war eine rekombinante VacA-Variante, die durch Deletion einer hydrophoben Region (Aminosäuren 6-27) hergestellt wurde, nicht in der Lage, eine Vakuolisierung zu indúzieren und den Calciumeinstrom zu blockieren. Ein wichtiges Ergebnis dieser Arbeit war es zu zeigen dass eine der Hauptkomponenten der Calciumaufnahme (Store-Operated Calcium Entry, SOCE), das ER-lokalisierte Calcium-Sensorprotein STIM1, als Zielmolekül für VacA dient. Mittels Kolokalisationsstudien und einem Yeast Two-Hybrid-Verfahren (YTH) konnte gezeigt werden, dass VacA im ER-Lumen lokalisiert ist und mit der calciumbindenden (EF-hand) –Domäne von STIM1 interagiert. Der Transport von STIM1 zur Plasmamembran und zu dem dort lokalisierten Calciumkanal ORAI1 ist nach Calciumdepletion mit Thapsigargin in Gegenwart von VacA deutlich reduziert. Mittels eines YTH Screens konnte die EF-hand-Domäne von STIM1 als Interaktionspartner von VacA identifiziert werden. Die im Rahmen dieser Arbeit beobachtete Aktivität von VacA bei der Modulation der intrazellulären Calcium-Signaltransduktion liefert damit neue Erkenntnisse, die für ein genaueres Verständnis der durch VacA hervorgerufenen Inhibition der T-Zell-Proliferation und Signaltransduktion notwendig sind.