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Harder, Ulrike (2014): Amino acid analysis in biofluids using LC-MS/MS: method development, validation and application in clinical research and dairy science. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät
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Abstract

Klinische Studien zeigen, dass die Zusammensetzung von zirkulierenden, freien AS im Blut, ein Marker für monogene und multigenetische Krankheiten ist. Die Analyse von hohen Probandenzahlen in klinischen Studien wird oftmals durch aufwendige und lange Probenaufarbeitungsschritte begrenzt. Im Rahmen der Metabolomics Plattform, die im Dr. von Haunerschen Kinderspitals etabliert wurde, wurde eine Hochdurchsatzmethode entwickelt, die eine selektive, sensitive, präzise und robuste Quantifizierung von 22 AS aus kleinen Probenvolumina ermöglicht. Im Laufe der Zeit konnten noch weitere Aminosäuren zur Methodik hinzugefügt werden. Dabei können innerhalb von 36 Stunden 96 Proben analysiert werden. Mit Hilfe eines deuterierten, interenen Standards in methanolischer Lösung werden Proteine aus nur 10 μL Probenvolumen gefällt. Zur Quantifizierung der AS wird anschliessend der eingedampfte Überstand derivatisiert und in Kombination mit einem Ionen-Paar- Reagenzes chromatographiert. Der Methodenaufarbeitung liegt eine umfassende und ausführliche Validierung zugrunde, die einer Interday Precision von 3.1 -10.8 % für alle Analyten erzielt. Zusätzlich unterzieht sich unsere Methode jedes Jahr an einem Ringversuch, der eine exakte Bestimmung aller Analyten gewährleistet. Im Zusammenhang mit der Programmierung des Stoffwechsels durch die Ernährung im Säuglingsalter wurde die neu entwickelte AS-Methode zur Quantifizierung von 726 Serum Proben in einer randomizierten klinischen Studie eingesetzt. Dabei wurde der Bezug zwischen Proteinzufuhr (Formelnahrung mit hohem Eiweißanteil bzw. niedriegem Eiweißanteil) und AS-Profil bei 6 Monate alten Säuglingen analysiert. Eine signifikante Veränderung der Plasmakonzentrationen zeigte sich in der Gruppe der formelernährten Kindern mit hohem Proteinanteil für folgende AS: BCAA, Gly, Lys, Met, Phe, Pro, Thr, Trp und Tyr. Essentielle AS werden über die Nahrung aufgenommen und vermutlich über das L-Transportsystem in die Zirkulation freigesetzt. Im Vergleich dazu werden nicht essentielle AS im Darm katabolisiert und mit Hilfe der de novo Synthese in gleichbleibenden Konzentrationen reguliert, sodass kein signifikanter Unterschied in beiden Gruppen beobachtet wurde. Durch eine proteinreiche Nahrung können AS vermehrt an der Aktivierung von Wachstumshormonen (mTOR, IGF-1) teilhaben, was sich im vermehrten Zellwachstum und –proliferation manifestiert. Nichts desto trotz kann die vermehrte Wachstumshormonaktivierung Krankheiten wie Insulinresistenz, Diabetes oder auch Übergewicht hervorrufen. Aufgrund des erhöhten Krankheitsrisikos ist einerseits von einer proteinreichen Ernährung im frühen Säuglingsalter abzuraten, andererseits kann das Stillen bzw. eiweißänhnliche Brustmilchzusammensetzung gesundheitsunterstützend sein. Auch im Rahmen eines Supplementierungsprojektes bei Kühen, hat sich die neu entwickelte AS-Methode bewährt. Dazu wurden jeweils 10 Kühe kurz vor und nach der Geburt mit CLA (CLA-Gruppe) oder mit Linolsäure (Kontroll-Gruppe) supplementiert. Ziel der Studie war es, den Zusammenhang zwischen CLA Supplementierung und AS- Profil im Blut zu analysieren. Dazu wurden zu insgesamt 8 Zeitpunkten vor und nach der Geburt, Blutproben entnommen. Es kristallisierten sich 3 verschiedene Zeitverläufe heraus, wobei die meisten AS-Konzentrationen nach der Geburt abfallen und langsam wieder auf ihre Ausgangswerte ansteigen. AS wie Glu sinken vor der Geburt stark ab, was dafür sprechen könnte, dass der Fetus mit ausreichend Glu versorgt wird und nach der Geburt vermehrt in die Milch transportiert wird. Gly, HPro, MHis und Ser steigen bis zur Geburt an und fallen dann wieder ab wobei Mhis durch den Muskelproteinabbau keinen Konzentrationsanstieg in den ersten 12 Laktationswochen erfährt. Die Supplementierung mit CLA zeigte keinen signifikanten Unterschied beider Gruppen auf das AS-Profil und zeigte somit keine Auswirkungen auf die AS-Synthese.

Abstract

Clinical studies show that the composition of circulating free AA in blood, are a marker for monogenetic and multigenetic diseases. The analysis of a large number of subjects in clinical trials is often limited by complicated and long sample preparation steps. As part of the metabolomics platform established at the Dr. von Hauner Children ́s Hospital, a high-throughput method was developed which allows a selective, sensitive, precise and robust quantification of 22 AA from very small sample volumes. Over time further AA were added to the methodology. All AA of 96 samples can be measured within 36 hours. Using an internal standard in methanolic solution proteins were precipitated from only 10 μL sample volume. For AA quantification, the evaporated supernatant is derivatized and analyzed with an ion-pair reagent. The methodology is based on a comprehensive and detailed validation with an interday precision of 3.1- 10.8% for all analytes. Every year we participate in a collaborative study which ensures an accurate determination of all analyses. In the context of early programming, the newly developed AA method was used for quantifying 726 serum samples in a randomized clinical trial. Here, the relation between different protein intake (formula with high or low protein content) and AA profiles at 6 month old infants was analyzed. A significant alteration in serum concentration was found in the HP group for following AA: BCAA, Gly, Lys, Met, Phe, Pro, Thr, Trp und Tyr. Essential AA were taken by nutrients and probably released from the L-transport system into circulation. In comparison, non essential AA are catabolized in the intestine and regulated by de novo synthesis in equal concentrations. Therefore, no significant difference of non essential AA was observed between HP and LP group. High protein diet leads to an activation of growth hormones (mTOR, IGF-1) by enhanced availability of AA which is manifested in increased cell growth and proliferation. Nevertheless, the increased hormone activation can causes diseases such as insulin resistance, diabetes or obesity. Because of the increased risk for diseases a high protein diet in early infancy is not recommended but breast feeding or low protein diet can have beneficial effects for health. Within a cow supplementation project, the newly developed AA method has proved effective. From two weeks before to nine weeks after expected calving one group (CLA group, n=10) was supplemented with CLA and one group (control group, n=10) was supplemented with linoleic acid. The aim of the study was to analyze the relation between CLA supplementation and AA profiles in blood samples. These were taken at a total of eight times before and after delivery. We observed three different time courses of AA. In most cases AA levels decreased after delivery and afterwards concentrations increased slowly to their initial values. Glu is decreased before delivery which may indicate that the fetus is supplied sufficient with Glu. After delivery Glu is increasingly transported in the milk. Gly, HPro, MHis and Ser increased after delivery and then moved back to basal values where MHis did not increase in the first 12 weeks due to muscle protein breakdown. CLA supplementation showed no significant difference between the two groups on the AA concentrations and thus showed no effect on AA synthesis.