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Vaerst, Barbara (2013): Neue molekulare Charakteristika von Zellisolaten aus Dupuytren- Gewebe. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät
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Abstract

Zielsetzung und Fragestellung: Goldstandard in der Therapie des fortgeschrittenen Morbus Dupuytren ist nach wie vor die partielle Aponeurektomie mit allen bekannten Nebenwirkungen. Mit dem Ziel, neue therapeutische Strategien zu entwickeln, haben wir Zellen aus gesunder Palmaraponeurose (Kon) isoliert, molekularbiologisch charakterisiert und mit Zellisolaten der Palmaraponeurose von Patienten mit einer Erstmanifestation von Morbus Dupuytren (PrimDup) sowie von Patienten mit Morbus-Dupuytren-Rezidiv (RezDup) verglichen. Da Zellen der Palmaraponeurose von Morbus-Dupuytren-Patienten Merkmale von Stammzellen wie z.B. die Fähigkeit von Fibroblasten zu Myofibroblasten zu transdifferenzieren haben, wurde neben der Zellmorphologie und dem Integrinprofil der Zellen auf RNA-Ebene insbesondere das Wachstumsverhalten und der Stammzellcharakter untersucht.

Abstract

Material und Methoden: Aus insgesamt 15 Dupuytren-Präparaten, die im Rahmen von partiellen Aponeurek-tomien angefallen waren, wurden jeweils 3 Spender ohne extrinsische Risikofaktoren (PrimDup) und 3 Spender, die an einem Rezidiv erkrankt waren (RezDup), selektiert. Die Zellen wurden mittels Kollagenaseverdau isoliert und unter Standard-Zellkulturbedingungen expandiert. Palmaraponeurose gesunder Spender diente als Kontrolle (Kon). Wachstumskurven der 3 Zelltypen wurden über 100 Tage erstellt. Außerdem wurden Colony forming units Assays (CFU) über 14 Tage in jungen und alten Passagen durchgeführt. Die Zellen wurden nach etablierten Protokollen osteogen und adipogen differenziert. Darüber hinaus wurde die Fähigkeit der Zellen myotubes zu bilden untersucht. Eine semiquantitative PCR Analyse wurde als Screening für alle Integrine und als detaillierte Untersuchung für die Integrine α2, β3, β5 und für Fibronektin durchgeführt. Ergebnisse: PrimDup-Zellen wuchsen signifikant schneller als RezDup-Zellen, die wiederum schneller wuchsen als Kon-Zellen. PrimDup- und Kon-Zellen gelangten nach ca. 40 Tagen in Seneszenz, während RezDup-Zellen über 100 Tage in Zellkultur proliferierten. Der CFU Assay ergab vergleichbar für Zellen der Passagen 2-5, dass PrimDup Zellen ca. 100 Kolonien pro Petrischale ergeben, während RezDup Zellen 40 Kolonien pro Schale und Kon Zellen 20 Kolonien pro Schale erreichten. In hohen Passagen drehte sich dieses Verhältnis um, denn PrimDup und Kon Zellen bildeten keine Kolonien mehr, während RezDup Zellen ca. 80 Kolonien pro Schale formten. RezDup- und PrimDup-Zellen differenzierten am stärksten adipogen und osteogen. Demgegenüber differenzierten Kon-Zellen nur mäßig adipogen und osteogen. Die PCR-Analyse zeigte, dass sowohl die Fibronektin-bindenden Integrine β3 und β5 als auch das Kollagen-bindendende Integrin α2 in PrimDup- und RezDup-Zellen im Vergleich zu gesunden Zellen der Palmaraponeurose deutlich vermehrt exprimiert wurden. Fibronektin selber war in den Zellen allerdings nicht erhöht.

Abstract

Schlussfolgerungen: Die Zellen der verschiedenen Gruppen unterscheiden sich phänotypisch erheblich. PrimDup-Zellen wachsen schneller als RezDup-Zellen, was nahelegt, dass in Prim-Dup-Zellen eine Störung der Wachstumsregulation vorliegt. Da RezDup-Zellen in-nerhalb von 100 Tagen nicht das Seneszenzstadium erreichen, muss angenom-men werden, dass diese Zellen zusätzliche Defekte in Seneszenz-kontrollierenden Genen haben. Dies könnte erklären, warum der Morbus Dupuytren in einigen Fällen rezidiviert und in anderen nicht. Sowohl RezDup- als auch PrimDup-Zellen zeigten eine deutlich bessere adipogene und osteogene Differenzierbarkeit als die gesunden Kontrollen, was darauf hinweist, dass Morbus Dupuytren-Zellen eine weniger differenzierte Vorstufe von Fibroblasten darstellen könnten. Fibronektin, welches, wie bereits gezeigt, in Dupuytren-Gewebe hoch reguliert ist, zeigt sich in allen isolierten Zellen in der PCR-Analyse auf dem gleichen Level. Der Grund dafür könnte in der Tatsache begründet sein, das Fibronektin ein Matrixprotein ist, welches sezerniert wird. Dass allerdings die fibronektin-bindenden Integrine β3 und β5, sowie das Kollagen-bindende Integrin α2 in Dupuytren-Zellen erhöht sind, könnte bedeuten, dass Zell-Matrix-Interaktionen ebenfalls den Verlauf der Krankheit beeinflussen. Hier könnte ein Ansatzpunkt für zukünftige Therapieansätze liegen.