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Hirschi, Benjamin (2012): Etablierung genetischer Modellsysteme der kolorektalen Karzinogenese und Abhängigkeit onkogener Merkmale von B-Raf(V600E), Genetic model of colorectal cancer and B-Raf(V600E) dependent cancer traits. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät
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Abstract

Für ein genetisches Modell B-Raf(V600E)-mutierter Darmkrebszellen und korrespondierender Wildtyp-Zellen wurde erstmalig in Deutschland das Somatic Cell Gene Targeting eingesetzt. Dabei konnte demonstriert werden, dass RKO eine Oncogene Addiction bezüglich der BRAF-Mutation aufweist. Als weitere B-Raf(V600E)-abhängige Effekte wurden die Selbstversorgung mit Wachstumssignalen (Self-Sufficiency of Growth Signals) und die Resistenz gegen Apoptose in dem Modell festgestellt. Darüber hinaus war die proliferative Kontaktinhibition in V600E-mutierten Klonen durch eine verstärkte Akt-Phosphorylierung aufgehoben und wurde nach Knockout der mutierten Allele im Wildtyp-Zellklon RBW-1 wieder hergestellt. Somit konnten vier zentrale Merkmale der Onkogenität dem mutierten B-Raf(V600E) zugeordnet werden. Andere onkogene Mechanismen waren dagegen vermutlich aufgrund einer Mutation der PI3-Kinase auch in BRAF-Wildtyp-Zellen noch intakt. So waren das Wachstum unter guten Kulturbedingungen und eine verstärkte Expression des EGF-Rezeptors unter Mangelbedingungen nicht vom BRAF-Mutationsstatus abhängig. Außerdem behielten Wildtyp-Zellen ihre Immortalisierung bei und zeigten weiterhin kein relevantes Auftreten von Seneszenz. Es wurden neue Spleißvarianten des BRAF-Gens gefunden und basal charakterisiert. Die alternativen Transkripte zeigten keine Kinase-Aktivität und waren in einem Ausmaß nachweisbar, das eine physiologische Bedeutung vermuten lässt. Hinsichtlich der Herkunft-Allele alternativer Isoformen und den Ursachen für das Auftreten alternativen Spleißens wurden neue Erkenntnisse gewonnen, die zudem die Interpretation publizierter Daten erleichtern. Es wurde gezeigt, dass die durch E-Cadherin vermittelten Zellkontakte essentiell für die epitheliale Komponente der intestinalen Barriere sind. Darüber hinaus wurde der Einfluss von E-Cadherin auf die Ausreifung sekretierender Zellen im Darm ermittelt und damit ein weiterer entscheidender Mechanismus der Abwehr bakterieller Invasionen aufgeklärt.

Abstract

In order to establish a genetic model of B-Raf V600E mutated colorectal cancer cells and corresponding wild-type tumor cells, the method of somatic cell gene targeting was successfully applied for the first time in Germany. Using this approach it was demonstrated that RKO cells show an oncogene addiction for B-Raf(V600E). Furthermore, self-sufficiency of growth signals and resistance against apoptosis were found to be B-Raf(V600E) dependent effects. Moreover, contact inhibition of proliferation was found in RBW-1 wild-type cells while it was abrogated in V600E mutated cell clones by an increased phosphorylation of Akt kinase. Therefore, four crucial hallmarks of cancer were dependent on the B-Raf(V600E) mutation. Presumably due to a mutation of PI3 kinase in RKO cells other cogenic mechanisms were still intact in RBW-1 wild-type cells. Namely the high proliferation rates under optimal conditions and the increase of EGFR expression under serum deprivation were independent from BRAF mutation status. Additionally, BRAF wild-type cells kept their immortality and still showed no relevant amount of cellular senescence. New splicing variants of the BRAF gene were found and characterized. The correspondent gene products showed no kinase activity and were detectable in amounts that indicate a physiological role. New insights into the allelic origin of alternative isoforms have been gained facilitating the interpretation of published data. It has been shown that E-Cadherin mediated cell-cell contacts are essential for the epithelial contribution of the intestinal barrier. Moreover, the role of E-Cadherin in the maturation of secreting cells in the intestine was determined, elucidating a crucial role in the defense against bacterial invasion.