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Porres, Christian (2012): Neural circuit analysis of the dorsal nucleus of the lateral lemniscus and new viral approaches to neural circuit analysis in Mongolian gerbils. Dissertation, LMU München: Fakultät für Biologie
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Abstract

Auditory stimuli are processed by several parallel and serial neural circuits in the auditory brainstem. In the first part of this PhD thesis, synaptic integration of excitatory inputs in the neural network of the dorsal nucleus of the lateral lemniscus (DNLL) in Mongolian gerbils is investigated. The second part of this study analyses the feasibility of the use of viral vectors in Mongolian gerbils. This work aims to add to the available methods for neural circuit analysis in these animals by establishing tools for genetic manipulation. The DNLL receives excitatory inputs from the superior olivary complex (SOC) and provides GABAergic inhibition to its contralateral counterpart and both inferior colliculi (ICs). This GABAergic inhibition can outlast the triggering auditory stimulus by tens of milliseconds and thus differs substantially from the fast glycinergic inhibition prevailing in the SOC. It is thought that this persistent inhibition (PI) suppresses further processing of sound source information cues of lagging sounds, thereby providing the neuronal basis for sound localisation in reverberant environments. The mechanisms which PI is generated are still under debate. One hypothesized mechanism focuses on the output mechanism in DNLL neurons, favouring transmitter spillover or asynchronous release to evoke PI. A second mechanism states that integration of excitatory inputs leads to temporally extended activity in DNLL neurons, thereby prolonging the GABAergic output. Here, we tested in vitro the feasibility of the integration based mechanism in Mongolian gerbils. We analyzed the integration of excitatory inputs to DNLL neurons and found that five simultaneously stimulated excitatory fibres, each releasing on average ~18 vesicles are sufficient to trigger a single action potential (AP) in a DNLL neuron. A strong presynaptic stimulation pulse could trigger multiple APs. The input-output functions (IO-Fs) of DNLL neurons were dependent on NMDA receptor (NMDAR) mediated currents, which temporally extended the neuron's activity. The synaptic IO-Fs of DNLL neurons could also be modulated by voltage gated potassium, but not by calcium conductances.The NMDAR dependent activity amplification, which is maintained into adult stages, is shown to prolong the GABAergic output of DNLL neurons, thus contributing to PI generation. Viral vectors are widely used to alter the genetic content of a host organism. In Mongolian gerbils this approach may be suitable to compensate for the lack of genetic strategies in neural circuit analysis such as transgenic animal lines. Lentiviral and Semliki forest viral vectors were stereotactically injected into the IC or the medial nucleus of the trapezoid body (MNTB) in Mongolian gerbils. The lentiviral constructs were able to induce expression of the transgenic protein in the IC but not in MNTB principal neurons. The Semliki forest viral vector induced expression in both nuclei but also caused strong cytotoxic effects in the infected cells. In a further experiment, an eGFP expressing pseudorabies virus based on the attenuated Bartha strain (PRV-152) was stereotactically injected into the IC and was able to retrogradely infect the nuclei of the auditory brain stem in juvenile and adult Mongolian gerbils. PRV-152 spread synaptically to 2nd order neurons by ~20 hours after injection. Infection could also be started in the DNLL and showed a strongly pronounced neurotropism. The virus induced eGFP expression was high and allowed for a detailed visualization of the infected neurons, establishing PRV-152 as an effective tool for anatomical circuit analysis. The feasibility of using this virus in conjunction with electrophysiological investigations was also tested. 37% of 1st and 78% of 2nd order infected neurons show a significant decrease of excitability, which impedes the use of PRV-152 in combination with electrophysiological recordings for physiological analysis of neural circuits.

Abstract

Auditorische Stimuli werden in verschiedenen parallel und in Serie angeordneten neuralen Netzwerken des auditorischen Hirnstamms verarbeitet. Im ersten Teil dieser Dissertation wird die synaptische Integration exzitatorischer Eingänge zu Neuronen des dorsalen Nukleus des lateralen Lemniscus (DNLL) der mongolischen Wüstenrennmaus untersucht. Der zweite Teil der Arbeit betrachtet die Möglichkeit des Einsatzes viraler Vektoren in der mongolischen Wüstenrennmaus. Das Ziel war es, die Palette der verfügbaren Methoden zur Analyse neuronaler Netzwerke in diesen Tieren um einen genetischen Ansatz zu erweitern. Der DNLL erhält exzitatorische Eingänge vom superioren Olivenkernkomplex (SOC) und sendet GABAerge inhibitorische Projektionen zum kontralateralen DNLL und zu beiden inferioren Colliculi (ICs). Diese GABAerge Inhibition kann den auslösenden auditorischen Reiz für mehrere Millisekunden überdauern und unterscheidet sich damit grundsätzlich von der im SOC vorherrschenden schnellen, glycinergen Inhibition. Es wird vermutet, daß diese persistierende Inhibition (PI) die weitere Verarbeitung räumlicher Information von Echos unterdrückt und damit eine neuronale Grundlage zur Schallquellenlokalisation in nachhallenden Umgebungen bildet. Die Mechanismen zur Generierung der PI sind nicht vollständig erklärt. Eine mögliche Erklärung zielt auf den Mechanismus der Neurotrnasmitterausschüttung in DNLL Neuronen. Demzufolge könnten Neurotransmitter "spill over" oder asynchrone Transmitterausschüttung die GABAerge Inhibition der DNLL Neurone zeitlich verlängern. Ein zweiter Mechanismus argumentiert, daß die Aktivität in DNLL Neuronen durch die Integration exzitatorischer synaptischer Eingänge zeitlich ausgedehnt wird und somit auch die Inhibition die die DNLL Neurone auf ihre Zielzellen ausüben. In dieser Arbeit wurde mit Hilfe der "patch-clamp" Methode die Integration exzitatorischer Eingänge in DNLL Neuronen untersucht mit dem Ziel die mögliche Existenz dieses zweiten Mechanismus zu zeigen. Die Ergebnisse zeigen, daß fünf simultan erregte exzitatorische Fasern benötigt werden, die im Durchschnitt ~18 Vesikel ausschütten, um ein Aktionspotential (AP) in einem DNLL Neuron auszulösen. Ein einzelner starker präsynaptischer Stimulationspuls ist außerdem ausreichend mehrere APs auszulösen. Die Input-Output Funktionen (IO-Fs) von DNLL Neuronen sind abhängig von NMDA Rezeptorströmen, welche die Aktivität von DNLL Neuronen zeitlich verlängern. Anders als Kalziumleitfähigkeiten sind auch Kaliumleitfähigkeiten in der Lage die IO-Fs von DNLL Neuronen zu beeinflussen. Die NMDA Rezeptorstrom abhängige Aktivitätsverlängerung in DNLL Neuronen ist sowohl in juvenilen, als auch in adulten Tieren vorhanden und gipfelt in einer Verlängerung der GABAergen Inhibition die von DNLL Neuronen generiert wird. Somit ist die Integration exzitatorischer Eingänge in DNLL Neuronen grundsätzlich geeignet zum Enstehen der PI beizutragen. Virale Vektoren werden benutzt um den genetischen Inhalt eines Organismus zu verändern. In mongolischen Wüstenrennmäusen, von denen es derzeit keine transgenen Tierlinien gibt, können virale Vektoren benutzt werden diesen Nachteil auszugleichen. Wir haben lentivirale Vektoren und Vektoren basierend auf dem Semliki Forest Virus (SFV) stereotaktisch in den IC und den medialen Nukleus des Trapezkörpers (MNTB) von mongolischen Wüstenrennmäusen injiziert. Die lentiviralen Konstrukte induzieren die Expression des transgenen Proteins im IC, nicht aber in MNTB Neuronen. Der SFV-Vektor ist in der Lage in beiden Nuklei Expression auszulösen, entfaltet aber zusätzlich eine stark zytotoxische Wirkungen. In einer weiteren Experimentreihe wurde ein eGFP exprimierender attenuierter Pseudorabiesstamm (PRV-152) in den IC injiziert. Dieser Vektor ist in der Lage alle Nuklei des auditorischen Hirnstamms retrograd der Injektionsstelle in juvenilen und adulten mongolischen Wüstenrennmäusen zu infizieren. Die PRV-152 Infektion breitet sich nach etwa 20 Stunden über die erste Synapse zu infizierten Zellen zweiter Ordnung aus. Die PRV-152 Infektion kann ebenfalls vom DNLL ausgehend ausgelöst werden und zeigt einen ausgeprägten Neurotropismus. Die induzierte Expression des eGFPs ist hoch und ermöglicht eine deutliche Darstellung der infizierten Neurone, so daß PRV-152 ein vielversprechendes Werkzeug zur anatomischen Untersuchung neuronaler Netzwerke darstellt. Ebenfalls wurde untersucht, ob die PRV-152 Infektion zusätzlich die elektrophysiologische Untersuchung der infizierten Neurone erlaubt. 37% der infizierten Neurone erster Ordnung und 78% der infizierten Neurone zweiter Ordnung zeigen eine signifikant heruntergesetzte Erregbarkeit. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, daß PRV-152 eine anatomische, nicht aber eine elektrophysiologische Untersuchung neuronale Netzwerke ermöglicht.