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Wallner, Stefan (2012): Skeletal muscle pericytes as signal mediators in the vessel wall: isolation and functional characterization in a hamster model. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät
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Abstract

In this thesis a novel method to isolate and cultivate pericytes from hamster skeletal muscle is presented. By choosing a two-step approach with magnetic-bead cell sorting for the 3G5 antigen and culture in a selective growth medium a high percentage of pericytes could be reached and their nature could be verified in subsequent characterization steps. Morphologically the cells had a typical phenotype with flat and large cell bodies and long protruding processes. Immunocytochemistry and western blotting could confirm the expression of the previously reported pericyte markers NG2, PDGFR-β, and αSMA. However, in accordance with previous reports, even the cells isolated from the same muscle and tissue, were not a uniform population. A certain heterogeneity was also present in the functional studies investigating pericyte membrane channels by electrophysiology. In these experiments in a subset of the pericyte population the presence of the voltage sensitive potassium channel KV1.5 could be demonstrated. Upon pharmacological stimulation of these channels by FFA they were able to elicit a membrane hyperpolarization and conduct it to neighboring endothelial cells via gap junctions formed by connexin 43. The expression of the KV1.5 channel could also be demonstrated by immunohistochemistry in paraffin sections from hamster skeletal muscle. These findings are consistent with the hypothesis that pericytes could act as signal generators for hyperpolarization and vasodilatation in the vessel wall. The coupling with endothelial cells might relay an electric signal further along the vessel wall and lead to “EDHF mediated” dilations [48]. Interestingly in tissue sections KV1.5 positive pericytes were located predominantly at vascular branchings. We additionally studied whether gap junctions may also form a pathway for the exchange of miRNA between cells in a model co-culture system using HeLa. For the detection of the miRNA a detector system consisting of a luciferase reporter protein under control of a miR124 sensitive 3’ UTR was established. Our experiments could not conclusively confirm transfer of miRNA in this system. Similar results were obtained with human miR15b. Taken together these findings open up new possibilities for studying skeletal muscle pericyte physiology and to test novel concepts integrating the pericyte into the vascular signaling network under conditions of health and disease.

Abstract

In diesem Promotionsprojekt wird eine neue Methode zur Isolation und Kultivierung von Perizyten aus der Skelettmuskulatur von Hamstern vorgestellt. Durch einen zwei stufigen Ansatz mittels selektiver Isolation von Zellen mit dem 3G5 Antigen und die Kultivierung in einem selektiven Wachstumsmedium konnte in den nachfolgenden Charakterisierungsschritten ein hoher Anteil an Perizyten nachgewiesen werden. Morphologisch hatten die Zellen einen Phänotyp mit typischem flachen und großen Zellkörper und langen Fortsätzen. In der Immunhistochemie und im Western Blot konnte die Expression der bekannten Perizytenmarker NG2, PDGFR-β, und αSMA bestätigt werden. In Übereinstimmung mit der Literatur waren sowohl Morphologie, als auch die Markerexpression nicht einheitlich, sogar bei Zellen aus demselben Muskel und Gewebe. Dies ist mit der Existenz von funktionell unterschiedlichen Populationen von Perizyten vereinbar. Eine Heterogenität der isolierten Perizyten zeigte sich auch in den funktionellen Untersuchungen der Perizytenmembran mittels Elektrophysiologie. Bei diesen Experimenten konnte in einem Teil der Perizytenpopulation der spannungsabhängige Kaliumkanal KV1.5 nachgewiesen werden. Durch pharmakologische Stimulation dieses Kanals mit Flufenamsäure (FFA) konnte in den Zellen eine Hyperpolarisation der Zellmembran erzeugt werden, die über durch Connexin 43 gebildete gap junction Kanäle an benachbarte Endothelzellen weitergeleitet werden konnte. Das Vorhandensein von KV1.5 konnte auch immunhistochemisch an Paraffinschnitten aus Hamstermuskel nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse sind gut vereinbar mit der Hypothese, dass Perizyten als Signalgeneratoren für eine Hyperpolarisation der Gefäßzellen dienen und so eine Vasodilatation induzieren. Durch Kopplung von Perizyten und Endothelzellen kann ein elektrisches Signal entlang der Gefäßwand stromaufwärts eine „EDHF ähnliche“ Vasodilatation auslösen. Interessanterweise befanden sich KV1.5 positive Perizyten in Gewebeschnitten bevorzugt an Aufzweigungen von Gefäßen. Zusätzlich untersuchten wir mit Hilfe eines HeLa Ko-Kultursystemes die Möglichkeit des direkten Austausches von miRNA über gap junctions. Zur miRNA Detektion etablierten wir einen Luciferasereporters, der unter der Kontrolle einer miR124 sensitiven 3‘ UTR stand. Nach zwei Tagen Ko-Kultur ließ sich jedoch nicht schlüssig zeigen, dass ein solcher Transfer von miRNA stattfand. Dies gilt auch für zusätzliche Experimente mit der humanen miR15b. Zusammenfassend eröffnen diese Ergebnisse neue Möglichkeiten die physiologischen Eigenschaften von Perizyten aus Skelettmuskel zu untersuchen und neue Konzepte zu testen, wie Perizyten im vaskulären Signalnetzwerk unter physiologischen Bedingungen bzw. bei Gefäßerkrankungen eingebunden sind.