The subcellular trafficking of the prion protein: Characterisation of the function of the PrPc N-terminus

Nunziante, Maximilian (2003): The subcellular trafficking of the prion protein: Characterisation of the function of the PrPc N-terminus. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) are degenerative diseases of the central nervous system in humans and animals, and include Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) in humans, scrapie in sheep and bovine spongiform encephalopathy in cattle. These spongiform encephalopathies can manifest as sporadic, familial and acquired disorders and are caused by the conformational alteration of the non-pathogenic cellular prion protein (PrPc) into a infectious isoform denoted PrPSc. The latter therefore represents a pathogenic agent (prion) which does not contain nucleic acids. During biogenesis, PrPc undergoes posttranslational modifications with the addition of two N-linked carbohydrate chains and a glycosyl-phosphatidyl-inositol-(GPI)-anchor. Properly folded PrPc transits through the Golgi compartment and the secretory pathway and is attached to the outer leaflet of the plasma membrane by the GPI-anchor. The cellular function of the prion protein is still unknown, although binding of copper to the octapeptide repeat sequence located at its N-terminus suggests a role of PrPc related to this phenomenon. In the present work, the physiological function of the N-terminal part of PrPc in subcellular trafficking was analysed. Metabolic labelling and surface-biotinylation assays were performed in order to compare the intracellular trafficking and turnover of PrPc mutants showing specific deletions within their N-terminal sequence with those of wild type PrPc (wtPrPc). Upon transient expression of these constructs in murine neuroblastoma cells, these deletions, although not influencing the biochemical properties or the cell surface expression of these proteins, lead to a delay in their endocytosis. The prolongation of the internalisation kinetics was shown to be dependent on the length of the deletion: truncation of the complete N-terminus leads to the almost complete inhibition of internalisation. The analysis of the kinetics of degradation showed a similar correlation with the N-terminal part of PrPc, since the half-life of the PrP-mutants was significantly prolonged when compared to that of the wild type protein. Additionally performed detailed analysis of the secretory pathway with immunoprecipitation assays showed that N-terminally truncated PrP molecules reach the plasma membrane at a later time point, when compared with wtPrPc. A closer analysis of the processing of the sugar molecules linked to these proteins performing an Endo-H digestion revealed that this delay in the transport to the cell surface takes place in a cellular compartment following the mid-Golgi. The following studies were done with a chimeric protein consisting of the short N-terminal segment of Xenopus laevis, which does not contain the copper-binding octarepeat region, fused to the N-terminally truncated mouse PrPc. These studies showed that endocytosis of this protein and its transport through the secretory pathway were comparable to those of the mouse wtPrPc. It was therefore concluded that the N-terminus belonging to a phylogenetically remote species can rescue the wild type trafficking phenotype. These results indicate that the N-proximal domain of the prion protein functions as a targeting element and is essential for both transport to the plasma membrane and modulation of endocytosis. The data support a model in which the N-terminal part of PrPc represents an epitope for binding to a transmembrane receptor containing internalisation-promoting motifs or for inclusion of PrPc into the secretory raft-compartments. The present work also indicates for the first time that copper affinity of the octarepeats and subcellular trafficking represent separate aspects in the life-cycle of the prion protein.

Abstract

Die transmissiblen spongiformen Enzephalopathien (TSEs) bilden eine Gruppe fataler degenerativer Erkrankungen des zentralen Nervensystems von Mensch und Tier, deren bekannteste Erscheinungsformen die bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE) beim Rind, die Traberkrankheit beim Schaf sowie die Creutzfeldt-Jakob-Erkrankung beim Menschen sind. Diese Erkrankungen können als Folge von Mutationen familiär-genetisch bedingt sein, infektiös erworben werden oder ohne erkennbare Ursache (sporadisch) auftreten. Das Auftreten und die Übertragung dieser Erkrankungen sind auf eine posttranslationale Umwandlung des apathogenen zellulären Prion-Proteins (PrPc) in eine infektiöse Isoform (Scrapie-Form, PrPSc) zurückzuführen, sodass dieses Protein ohne eine damit assoziierte Nukleinsäure als pathogenes Agens (Prion) fungiert. PrPc wird posttranslational glykosyliert und gelangt im Verlauf seiner Maturierung entlang des sekretorischen Transportwegs an die Zelloberfläche, an die es durch einen GPI-Anker verknüpft wird. Die Funktion des Prion-Proteins ist noch unbekannt, obwohl mehrere Untersuchungen eine Bindung von Kupfer an die N-terminal vorliegenden „Octarepeats“ von PrPc feststellen konnten und deshalb dem Prion-Protein eine mit dieser Eigenschaft in Zusammenhang stehende Funktion zugeschrieben wird. In der vorliegenden Arbeit wurde die physiologische Funktion des N-terminalen Anteils von PrPc im intrazellulären Transport untersucht. Mittels metabolischer Markierung und Oberflächen-Biotinylierung wurde das Verhalten und die Halbwertszeit von PrP-Mutanten, die spezifische Deletionen in der N-terminalen Sequenz aufweisen, mit denen des Wildtyp-Proteins (wtPrPc) verglichen. Nach transienter Expression dieser Mutanten in murinen Neuroblastomzellen konnte gezeigt werden, dass die Deletionen weder die biochemischen Eigenschaften noch die Zelloberfächenexpression dieser Proteine beeinflussen, aber dennoch zu einer signifikanten Verlangsamung ihrer Endozytose führen. Die Verlängerung der Internalisierungskinetik erwies sich als abhängig von der Länge der Deletion: die Abspaltung des kompletten N-Terminus erbrachte nahezu eine Inhibierung der Internalisierung des Proteins. Eine Analyse der Degradationskinetik zeigte weiterhin, dass dieser Prozess im gleichen Zusammenhang mit dem N-terminalen Bereich von PrPc steht, da die Halbwertszeit der untersuchten PrP-Mutanten deutlich länger ist als die des Wildtyp-Proteins. Wie durch detaillierte Analyse des sekretorischen Transportweges mittels Immunpräzipitation weiterhin gezeigt werden konnte, erreichen N-terminal verkürzte PrPs die äußere Plasmamembran zu einem späteren Zeitpunkt als das wtPrPc. Die Untersuchung der Glykosylierung dieser Proteine mittels Endo-H Verdau ergab, dass die Verzögerungen im Transport zur Zelloberfläche erst stattfinden, nachdem PrPc das mid-Golgi Kompartiment erreicht hat. Die Analyse eines chimären PrPs, bestehend aus dem N-Terminus von Xenopus laevis, der keine für die Kupferbindung wichtigen Octapeptide enthält, und aus einem N-terminal verkürztem Maus PrP, zeigte, dass sowohl die Endozytose als auch der sekretorische Transportweg dieses Proteins mit dem von murinem wtPrPc vergleichbar waren. Daraus konnte man schließen, dass der N-Terminus einer phylogenetisch entfernten Spezies den Wildtyp-Phenotyp wiederherstellen kann. Diese Ergebnisse deuten auf eine wichtige, konservierte Funktion des N-Terminus von PrPc im gesamten intrazellulären Transport, indem er als Signal für die korrekte Internalisierung und für die Beförderung an die Zelloberfläche dient. Die vorliegenden Daten unterstützen ein Modell, in dem der N-terminale Anteil des Prion-Proteins eine Bindungsstelle für einen transmembranen Rezeptor darstellt, der die Internalisierung bzw. die Eingliederung von PrPc in die sekretorischen Raft-Kompartimente begünstigt. Es konnte weiterhin erstmals gezeigt werden, dass Kupferbindung an die Octapeptide und intrazellulärer Transport voneinander unabhängige Entitäten im Lebenszyklus des Prion-Proteins darstellen.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 26. September 2003