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Schöpf, Julia (2011): Identifikation und Charakterisierung zellulärer Zielproteine zur antiviralen Therapie der SARS-Coronavirus Infektion. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät
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Abstract

The severe acute respiratory syndrome (SARS) was first observed in the Chinese province Guangdong in November 2002. The disease quickly spread around the globe via air travelling and caused a worldwide epidemic. Several research institutions together with the World Health Organisation (WHO) identified the SARS-coronavirus (SARS-CoV) as the causative agent of this disease. During the epidemic, about 8,000 people were infected with a mortality of approximately 10%. Although no new infections have been observed since the summer of 2003, a recurrence of the pathogen cannot be excluded. Up to now, no specific therapy against the virus have been available. Viruses contain a very compact genome, which does not encode all proteins necessary for independant replication. Thus, viruses necessarily depend on host proteins and have to interact directly with them. The analysis of protein-protein interactions between SARS-CoV and human host cells contributes to a better understanding of the viral replication and pathogenicity. Prior to this work, an automated, genome-wide yeast-two-hybrid (Y2H) screen between all 28 proteins of SARS-CoV and the gene products of three human cDNA libraries had been performed, and approximately 460, mostly new protein-protein interactions had been identified. The aim of this work was to confirm newly identified virus-host SARS-CoV protein interactions and to functionally analyse them to identify new targets for antiviral therapy. 89 newly identified protein-protein interactions were examined via a modified LUMIER binding-assay to confirm individual interactions. 37 out of 89 protein interactions were found to be positive, resulting in a confirmation rate of 42%. In subsequent functional analyses of protein-protein interactions between the SARS-CoV non-structural protein 1 (Nsp1) and proteins of the immunophilin family, two different functional consequences were observed. First, it could be shown that SARS-CoV Nsp1 boosts the expression of genes regulated via the calcineurin/NFAT-signalling cascade. The increased expression of NFAT-regulated genes in SARS-CoV infection may cause the cytokine dysregulation described in SARS patients which leads to severe lung tissue destructions and which correlates with high mortality. The considerably less harmful human coronavirus HCoV-NL63 and mouse coronavirus (MHV) did not boost the expression of NFAT-regulated genes. It was thus hypothesized that the therapy of the cytokine dysregulation with the immunosuppressive drug Cyclosporine A (CspA) might improve the course of the disease. In addition, it could be shown for the first time that the replication of the SARS-CoV can be inhibited by the immunosuppressive drug CspA. Subsequent experiments showed a similar inhibition of the viral replication of the less harmful human coronavirus HCoV-NL63 and HCoV-229E mediated by CspA. In cooperation with several groups of the ”SARS-Zoonose- Verbund”, further inhibition experiments were performed with animal coronaviruses like FCoV, IBV Bd and TGEV PUR46, which showed a similar antiviral effect of CspA. The two cellular proteins Cyclophilin A and FK506 binding-protein 1A were shown to be essential for viral replication of HCoV-NL63. The findings of this work may contribute to a better understanding of the interactions between SARS-CoV and infected host cells and their innate immune response. The application of the general coronaviral inhibitor CspA identified in this study and of non-immunosuppressive CspA analogues like DEBIO-025 procures promising options for anti-coronaviral therapy.

Abstract

Im November 2002 brach das Schwere Akute Atemwegssyndrom (severe acute respiratory syndrom, SARS) zum ersten Mal in der chinesischen Provinz Guangdong aus. Dieser Erreger verursachte aufgrund des internationalen Flugverkehrs erstmals eine weltweite Epidemie. Verschiedene Forschungseinrichtungen konnten in Zusammenarbeit mit der Weltgesundheitsorganisation (WHO) das SARS-assoziierte Coronavirus (SARS-CoV) als Erreger der schweren Krankheit identifizieren. Insgesamt wurden während der Epidemie etwa 8000 Menschen infiziert, von denen ca. 10 % verstarben. Obwohl seit Sommer 2003 keine Neuinfektionen mehr beobachtet wurden, kann ein erneutes Auftreten dieses Pathogens nicht ausgeschlossen werden. Bis heute steht keine spezifische Therapie gegen SARS-CoV zur Verfügung. Viren haben ein sehr kompaktes Genom, in dem nicht alle notwendigen Proteine kodiert sind, die für einen kompletten Infektionszyklus benötigt werden. Aus diesem Grund sind Viren ausnahmslos abhängig von den Protein-Protein-Interaktionen mit einer lebenden Wirtszelle. Die Analyse von Protein-Protein-Interaktionen zwischen dem SARS-CoV und der humanen Wirtszelle trägt zum besseren Verständnis der viralen Replikation und Pathogenität bei. Im Vorfeld dieser Arbeit wurde ein automatisierter, genomweiter Hefe-Zwei-Hybrid (H2H)-Screen zwischen allen 28 Proteinen des SARS-CoV und den Genprodukten von drei humanen cDNA-Banken durchgeführt, wobei ca. 460, zumeist völlig neue, Protein-Protein-Interaktionen zwischen dem SARS-CoV und dem humanen Wirt identifiziert wurden. Ziel dieser Arbeit war es, die neu identifzierten Protein-Protein-Interaktionen zu bestätigen und funktionelle Analysen ausgewählter Interaktionen durchzuführen, um neue Angriffspunkte für die antivirale Therapie zu finden. 89 Protein-Protein-Interaktionen, die im H2H-Screen neu identifiziert werden konnten, wurden mit Hilfe des modifizierten LUMIER Bindungs-Assays zur Bestätigung der einzelnen Interaktionen untersucht. Von diesen 89 getesteten Protein-Protein-Interaktionen waren 37 Tests positiv, wodurch sich eine Bestätigungsrate von 42 % ergab. In anschließenden funktionellen Analysen der Protein-Interaktionen zwischen dem SARS-CoV Nicht-Strukturprotein 1 (Nsp1) und Proteinen der Immunophilinfamilie konnten zwei Funktionen dieser Interaktionen aufgezeigt werden. Zunächst konnte gezeigt werden, dass das SARS-CoV Nsp1 die Expression von Genen, welche über die Calcineurin/NFAT-Signalkaskade reguliert werden, erhöht. Die SARS-spezifische Erhöhung der Expression NFAT-regulierter Gene kann eine Ursache der in SARS-Patienten beschriebenen Zytokindysregulation sein. Diese Zytokindysregulation führt zu schweren Gewebeschädigungen in der Lunge und trägt maßgeblich zum schlechten Ausgang der Krankheit bei. Das weniger pathogene humane Coronavirus HCoV-NL63 und das Maus-Coronavirus MHV zeigten diese Erhöhung der Expression NFAT-regulierter Gene nicht auf. Es wurde deshalb die Hypothese aufgestellt, dass eine Behandlung der Zytokindysregulation mit dem Immunsuppressivum Cyclosporin A positive Auswirkungen auf den Verlauf der Krankheit hat. Zum zweiten konnte erstmals gezeigt werden, dass die Replikation des SARS-CoV durch das Immunsuppressivum Cyclosporin A gehemmt werden kann. Anschließende Inhibitionsversuche der deutlich harmloseren humanen Coronaviren HCoV-NL63 und HCoV-229E zeigten die gleiche Hemmung der viralen Replikation durch Cyclosporin A. In Kooperation mit verschiedenen Arbeitsgruppen des SARS-Zoonose-Verbunds konnten weitere Inhibitionsversuche mit den Tiercoronaviren FCoV, IBV Bd und TGEV PUR46 durchgeführt werden und ebenfalls ein inhibitorisches Potential des Cyclosporin A auf die virale Replikation dieser Tiercoronaviren gezeigt werden. In weiterführenden Untersuchungen zum Wirkmechanismus der CspA- und FK506-vermittelten Inhibition der Replikation des humanen Coronavirus HCoV-NL63 konnten die beiden zellulären Proteine Cyclophilin A und FK506-Bindeprotein1A (FKBP1A) erstmals als essentielle Proteine für die virale Replikation identifiziert werden. Die Erkenntnisse dieser Arbeit können dazu beitragen, die komplexen Interaktionen zwischen dem SARS-CoV, der infizierten Wirtszelle und der Immunabwehr besser zu verstehen. Weiterhin konnte im Rahmen dieser Arbeit ein allgemeiner, coronaviraler Inhibitor in Form von Cyclosporin A identifiziert werden. Nicht-immunsuppressive Cyclosporin A Analoga wie DEBIO 025 sind deshalb mögliche Kandidaten für die Therapie coronaviraler Infektionen.