Expression eines rekombinanten humanen Proteins in vitro und in vivo in Eileiterzellen des Huhnes, am Beispiel von humanem Erythropoietin, hrEPO

Specht, Moritz von (2002): Expression eines rekombinanten humanen Proteins in vitro und in vivo in Eileiterzellen des Huhnes, am Beispiel von humanem Erythropoietin, hrEPO. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine

Abstract

Die Produktion heterologer, medizinisch verwertbarer Proteine in Tieren ist heute ein Standardverfahren und viele Spezies haben sich als hierfür geeignet erwiesen. Das Huhn sollte sich besonders als Bioreaktor eignen, es verfügt zum einen über kurze Generationszeiten, und in seinem Eileiter werden täglich grosse Mengen Protein gebildet und im Ei ausgeschieden. Dennoch war es bis heute, trotz zahlreicher Anstrengungen von verschiedenen Arbeitsgruppen nicht gelungen, den Organismus eines Huhnes genetisch derart zu verändern, dass ein heterologes Protein im Eileiter gebildet, und im Ei nachweisbar ausgeschieden wird. Im Rahmen der Experimente, die in dieser Dissertation vorgestellt werden, ist es erstmals gelungen im Eileiter des Huhnes ein heterologes Protein, EPO, zu exprimieren. Es konnte nachgewiesen werden, dass das Protein aus den Zellen des Eileiters ausgeschleust wird und schliesslich im gelegten Ei in grosser Menge zu finden ist. Hierzu wurden geeignete Genkonstrukte kloniert, in vitro in primären Eileiterzellen getestet, und schliesslich per Gengun-Verfahren in vivo in den Eileiter eingebracht. Die Expression erfolgte unter der Kontrolle des viralen CMV-Promotors, das EPO-Protein war in den Eiern der positiv getesteten Tieren über Wochen nachweisbar. Aufgrund dieses Erfolges wurde versucht eine gewebespezifische Expression unter der Kontrolle des Ovalbuminpromotors zu erreichen. Es gelang ein geeignetes Promotorkonstrukt zu identifizieren und zu klonieren, sowie in vitro eine gewebespezifische Expression von ß-Galactosidase zu erreichen, eine Expression von EGFP und EPO konnte jedoch nicht sicher nachgewiesen werden. Ursächlich hierfür ist das komplexe Regulierungssystem des Ovalbuminpromotors, das durch Transfektionsverfahren empfindlich gestört wird und in vitro-Versuche beinahe unmöglich macht. Unter zu Hilfenahme eines alternativen Transfektionsverfahrens, der Virofektion gelang es jedoch unter der Kontrolle des Ovalbuminpromotors in vivo einmalig EPO-Expression in das Hühnerei nachzuweisen. Experimente, die nach Abschluss der Arbeiten an dieser Dissertation durchgeführt wurden, haben die Funktionsfähigkeit der retroviralen Konstrukte bestätigt. Insbesondere konnte unter der Kontrolle des Ovalbuminpromotors eine zellspezifische Expression von ErythropoietinErythropoietin wird aktuell auf seine biologische Aktivität untersucht, die Veröffentlichung der Ergebnisse befindet sich in Vorbereitung. erreicht werden, die Transfektion hat sich als stabil erwiesen. Das so gewonnene

• Item Type: Theses (Dissertation, LMU Munich)
• Subjects: 600 Technology, Medicine; 600 Technology, Medicine > 610 Medical sciences and medicine
• Faculties: Faculty of Medicine
• Language: German
• Date of oral examination: 20. June 2002
• Signature of the printed copy: 0700/UMD 9764