Generierung muriner monoklonaler Antikörper und gentechnische Herstellung spezifischer Fab-Fragmente gegen die tumorassoziierte Isoform 1 des humanen Tenascin C für die Radioimmuntherapie von Gliomen

Wagner, Erika (2010): Generierung muriner monoklonaler Antikörper und gentechnische Herstellung spezifischer Fab-Fragmente gegen die tumorassoziierte Isoform 1 des humanen Tenascin C für die Radioimmuntherapie von Gliomen. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine

Abstract

Ein Problem bei der Behandlung von Gehirntumoren sind Resttumorzellen, die am Rande des Tumors gesundes Hirngewebe infiltrieren und operativ nicht entfernt werden können. Einen viel versprechenden Ansatz für die Therapie maligner Gliome stellt die lokale Applikation radioaktiv markierter monoklonaler Antikörper bzw. Antikörper-Fragmente dar, die gegen tumorspezifische Oberflächenmoleküle gerichtet sind. Ziel war es daher, monoklonale Antikörper (mAk) und gentechnisch hergestellte Fab-Fragmente gegen die tumorassoziierte Isoform 1 des humanen Tenascin C (hTNC-1) für die Diagnostik bzw. die Radioimmuntherapie (RIT) von Gliomen zu entwickeln. Die mAk wurden durch Immunisierung von Balb/c Mäusen mit einer der alternativ gespleißten FNIII-Domänen, die für hTNC-1 spezifisch ist, generiert. Diese FNIII-Domäne wurde hierzu gentechnisch hergestellt. Die Immortalisierung und klonale Selektion der erfolgreich herangereiften murinen B-Lymphozyten wurde, angelehnt an das von Kenett und Mitarbeitern entwickelte Protokoll, durchgeführt (Kennett, et al., 1978). Der Antikörper wurde aus den konditionierten Zellkulturmedien des entsprechenden Hybridoma Zellklons mit geringem Aufwand aufgereinigt. Die cDNA-Sequenzen der CH1- und der VH1-Domäne der H- und der L-Kette des neu generierten mAk wurden hierfür in den bakteriellen Expressionvektor pASK85-D1.3 kloniert und gentechnisch hergestellt. Die Fab-Produktion in E. coli konnte so im Labormaßstab etabliert werden. Nach in vitro Evaluation wurden die mAk und Fab-Fragmente mit Indium-111-DTPA radiomarkiert und in U87MG-tragenden SCID-Mäusen getestet. Der mAk mit der höchsten Avidität (WGGD4-B4) wies eine spezifische Bindung mit hoher Affinität (KD ~ 35 nM ± 16 nM) an WHO°III und WHO°IV Gliome auf. Gesunde Hirnareale werden mit diesem mAk nicht adressiert. Die an U87-MG-Tumoren tragende SCID-Mäusen durchgeführten Untersuchungen zeigten für den mAk WGGD4-B4 einen Anstieg der Aktivität im Tumor bis zu 72 h p.i., mit mittleren Anreicherungen von 11% der ID/g Tumor. Anschließend erfolgt eine langsame Dissoziation (~9% ID/g Tumor nach 120h p.i.). Die Aktivität in den Referenzgeweben (z.B. Muskel) blieb zu jedem gemessenen Zeitpunkt niedrig (Muskel <1,65% ID/g). Das gentechnisch hergestellte Fab-D4-B4 erwies sich mit 118 nM ± 23 nM als potenziell geeignet für die nuklearmedizinische Bildgebung. Die VH- und VL-Regionen des mAk WGGD4-B4 konnten mittels 5'-RACE-PCR gewonnen und in den Expressionsvektor pASK85-D1.3 kloniert werden und ermöglichte so eine effiziente Herstellung des Fab-Fragments. Die ebenfalls an U87MG-Tumoren tragenden SCID-Mäusen durchgeführten Untersuchungen, zeigten für dieses Fab eine rasche spezifische Anreicherung am Tumor (40% ID nach 1 h bei i. v. Gabe) und eine schnelle Ausscheidung (0,5% ID/g Tumor, 6 h p.i. und 52,7% ID/g Niere, 6 h p.i.). Das Ziel, mAk und Fab Fragmente zu entwicklen, die zwischen den einzelnen hTNC Isoformen diskriminieren können und somit nur am tumorassoziierten Antigen (TAA) hTNC-1 von Gliomen vom WHO°III und IV binden, konnte erreicht werden. In ersten in vivo Experimenten zeigten sich die In-111 markierten Derivate als sehr viel versprechend.

• Item Type: Theses (Dissertation, LMU Munich)
• Subjects: 600 Technology, Medicine; 600 Technology, Medicine > 610 Medical sciences and medicine
• Faculties: Faculty of Medicine
• Language: German
• Date of oral examination: 21. December 2010
• 1. Referee: Bartenstein, Peter
• Signature of the printed copy: 0700/UMD 14207