DNA-basierte molekulare Maschinen und Aktuatoren

Reuter, Andreas (2007): DNA-basierte molekulare Maschinen und Aktuatoren. Dissertation, LMU München: Fakultät für Physik

Abstract

In the emerging field of nanobiotechnology, deoxyribonucleic acid (DNA) has already established as a key building block with versatile properties. In the present thesis, self-organising and controllable nanoactuators and a functional "nanomachine", consisting of artificially synthesised short DNA strands, have been designed and characterised. The techniques employed for the construction and analysis of the DNA nanodevices are from the field of physics and biochemistry. The essential results of this work are: • Characterisation of the DNA tweezers in their open and closed configuration by the means of single-molecule fluorescence measurements. Hence the distribution of the transfer efficiency could be determined for both states and the influence of salt concentration on the distribution in the open state. Based on these results, the distributions of the distances between the dye molecules (and therefore the distances between both arms of the tweezers) could be calculated. For the closed state three subpopulations have been found. • The successful integration of gold nanoparticles into switchable DNA actuators. Here, the fluorescence emission of dyes was measured whose distance to a gold nanoparticle was varied by the DNA actuator. The bulk experiments showed that gold nanoparticles can be effectually used as quenchers for the fluorescent dyes in DNA nanoactuators to monitor distance changes ≥ 10 nm. • The existing concepts for the operation of nanomechanical DNA machines could be employed for the construction of the first switchable aptamer. Switchable aptamers fulfil the function of binding and releasing a protein or other molecules reversibly in a controlled way. In the present project, a molecular machine based on a DNA aptamer was constructed that can cyclically bind to the human protein thrombin and release it upon addition of fuel strands. In fact, one can imagine the developed aptamer machine as a specific "molecular claw". The mode of operation of this switchable aptamer was verified and characterised by fluorescence resonance energy transfer and fluorescence anisotropy measurements. To study the kinetics of the release of thrombin in detail the binding constant of the aptamer machine has been determined using fluorescence correlation spectroscopy measurements. A model of the single reaction steps has been put up, simulated numerically and fitted to the experimentally obtained curves. The combination of the operation principle of DNA based nanomechanical devices with the binding properties of DNA aptamers greatly expands the scope for the design and construction of further functional DNA nanodevices. It is assumed that in the near future single-molecule measurements will be increasingly employed within the development of DNA nanomachines and actuators to gain insight in the actually existing structures of these devices.

Abstract

In dem jungen Gebiet der Nanobiotechnologie hat sich Desoxyribonukleinsäure (DNA) bereits als ein Baustein mit vielseitigen Eigenschaften etabliert. In der vorliegenden Arbeit werden aus künstlich synthetisierten kurzen DNA-Strängen selbstorganisierte und steuerbare Nanoaktuatoren sowie eine funktionelle "Nanomaschine" entworfen und charakterisiert. Die zum Aufbau und der Untersuchung der DNA-Nanogeräte verwendeten Methoden kommen aus der Physik und aus der Biochemie. Wesentliche Ergebnisse dieser Arbeit sind: • Die Charakterisierung der DNA-Tweezers in der offenen und geschlossenen Konfiguration mittels Einzelmolekülfluoreszenzmessungen. Hierbei wurde die Verteilung der Transfereffizienzen für beide Zustände bestimmt und der Einfluss der Salzkonzentration beim offenen Zustand. Daraus konnten die Verteilungen für die Werte der Abstände zwischen den Farbstoffen (und damit zwischen den beiden Armen des Tweezers) ermittelt werden. Im geschlossenen Zustand wurden drei Subpopulationen entdeckt. • Gold-Nanopartikel unterschiedlicher Größe wurden erfolgreich in schaltbaren DNA-Aktuatoren implementiert. Hierbei wurde die Fluoreszenzemission von Farbstoffen gemessen, deren Abstand zu einem Gold-Nanopartikel über einen DNA-Aktuator variiert wurde. Die durchgeführten Ensemblemessungen zeigen, dass Gold-Nanopartikel erfolgreich als Quencher für Fluoreszenzfarbstoffe in DNA-Nanoaktuatoren eingesetzt werden können, um Abstandsänderungen ≥ 10 nm zu verfolgen. • In früheren Arbeiten entwickelte Konzepte zur Arbeitsweise nanomechanischer DNA-Maschinen konnten für die Konstruktion des ersten schaltbaren Aptamers eingesetzt werden. Schaltbare Aptamere sind in der Lage ein Protein oder sonstiges Molekül reversibel zu binden und wieder freizugeben. Im vorliegenden Fall wurde eine molekulare Maschine konstruiert, die auf einem DNA-Aptamer basierend das Protein Thrombin wiederholt binden und freigeben kann. Tatsächlich kann man sich diese Aptamermaschine als einen spezifischen "molekularen Greifer" vorstellen. Die Operationsweise dieses schaltbaren Aptamers wurde mit Fluoreszenzresonanz-Energietransfer- und Fluoreszenzanisotropiemessungen überprüft und charakterisiert. Um die Kinetik der Freigabe von Thrombin detailiert zu untersuchen, wurde die Bindungskonstante unserer Aptamermaschine mit einer Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie- Titration bestimmt und ein Modell der einzelnen Reaktionsschritte aufgestellt. Das System der Ratengleichungen wurde numerisch simuliert und an die experimentell ermittelten Kurven angepasst. Die Kombination des Operationssprinzips von DNA-basierten nanomechanischen Strukturen mit den Bindungseigenschaften von DNA-Aptameren erweitert bedeutend den Spielraum für die Konstruktion weiterer funktionaler DNA-Nanostrukturen. Es ist davon auszugehen, dass in Zukunft Einzelmolekülmessungen verstärkt bei der Entwicklung von DNA-Nanomaschinen und -aktuatoren eingesetzt werden, um Einblick in die tatsächlich vorliegenden Strukturen der DNA-Konstrukte zu gewinnen.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: DNA, Nanobiotechnologie, Fluoreszenzspektroskopie, Aptamer, molekulare Schalter
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 530 Physik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik
• Fakultäten: Fakultät für Physik
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 4. Juli 2007
• 1. Bericht­erstatter:in: Simmel, Friedrich C.