Zum Nachweis von pathogenen Prionen mittels "Kapillarelektrophorese-laserinduzierter Fluoreszenz (CE-LIF)"

Fritz, Markus (2006): Zum Nachweis von pathogenen Prionen mittels "Kapillarelektrophorese-laserinduzierter Fluoreszenz (CE-LIF)". Dissertation, LMU München: Tierärztliche Fakultät

Abstract

Zum Nachweis von PrPc und PrPsc wurde eine Kapillarelektrophorese-Immunofluoreszenz-Methode (CE-LIF) etabliert und mit konventionellen Verfahren (ELISA, Westernblot, Dot-EIA) verglichen. Zur CE-LIF wurde der monoklonale Antikörper F89 und ein Fluoreszenz-markiertes Peptid (FITC-P3) eingesetzt. Die Nachweisgrenze für rekombinantes bovines PrPc liegt bei 1 pg/Test. Zur Anreicherung von PrPsc aus Hirn und Liquor wurden (Ultra-) Zentrifugations-, Extraktions- (HFIP) und Chromatographieverfahren (HPLC, Festphasenextraktion) einzeln oder in Kom-binationen geprüft; darüber hinaus wurden Anreicherungsversuche mit Affinität- bzw. Immu-nomagnetischer Separation vorgenommen. Die Überprüfung des PrPsc-Gehaltes ausgewählter Extrakte im Vergleich zum Ausgangsma-terial mittels ELISA ergab deutliche Substanzverluste. Eine selektive Bindung von PrPsc an Dynabeads® gekoppeltem Plasminogen konnte nicht nachgewiesen werden. Dagegen wurde eine Anlagerung an Antikörper-beschichteten Beads festgestellt. Allerdings war die Bin-dungskapazität der Beads bei Versuchen in mit in PBS gelöstem PrPc oder PrPsc höher als bei vergleichbaren Versuchen mit Liquor. Bei der kapillarelektrophoretischen Analyse erwiesen sich alle mittels einfacher Probenauf-bereitung hergestellten Extrakte als ungeeignet. Sie führten entweder zu technischen Prob-lemen (Verstopfung der Kapillare; Durchbrennen) oder zu Interferenzen im Elektrophe-rogramm, die eine Auswertung nicht ermöglichten. Die Aufbereitung mittels HPLC ergab zwar verwendbare Präparationen, allerdings variierte die Retentionszeit von PrPsc derart stark, dass dieses Verfahren nicht weiter eingesetzt wurde. Bezüglich der Verwertbarkeit von CE-LIF wurden die besten Resultate mit Hilfe einer Aufreinigung nach Bio-Rad® mit an-schließender Festphasenextraktion erzielt. Während der Nachweis von PrPsc mittels CE-LIF aus Hirngewebe eindeutig gelang, führte die Untersuchung des Liquors eines bekannt BSE-positiven Tieres zu keinem eindeutigen Ergebnis. Prinzipiell ist die CE-LIF zum Nachweis von PrPsc geeignet. Allerdings handelt es sich dabei um ein sehr störanfälliges Verfahren. Die Sensitivität kann deutlich erhöht werden, wenn die Konzentration von PrPsc in kleine Volumina noch besser gelingt.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: BSE, CE-LIF, Prionen, Nachweisverfahren, Aufreinigungsverfahren
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 590 Tiere (Zoologie)
• Fakultäten: Tierärztliche Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 28. Juli 2006
• 1. Bericht­erstatter:in: Märtlbauer, Erwin