Nachweis, Expression und Bedeutung der von Bacillus cereus produzierten Enterotoxin-Komplexe

Moravek, Maximilian Karl (2006): Nachweis, Expression und Bedeutung der von Bacillus cereus produzierten Enterotoxin-Komplexe. Dissertation, LMU München: Tierärztliche Fakultät

Abstract

This work deals with the production of antibodies against each component of the Non-hemolytic enterotoxin (Nhe) of Bacillus cereus and their use for qualitative and quantitative analyses of the enterotoxin profiles of 100 B. cereus strains. To facilitate the detection of this toxin, consisting of the subunits NheA, NheB, and NheC, a complete set of high-affinity antibodies against each of the three components was established and characterized. A rabbit antiserum specific for the C-terminal part of NheC was produced using a respective synthetic peptide coupled to a protein carrier for immunization. Using purified B. cereus exoprotein preparations as immunogens, one monoclonal antibody against NheA and several antibodies against NheB were obtained. No cross-reactivity with other proteins produced by different strains of B. cereus was observed. Antibodies against the NheB component were able to neutralize the cytotoxic activity (up to 98 %) of Nhe. To evaluate the expression of HBL and Nhe, a set of 100 B. cereus strains was examined. Molecular biological characterization showed that 42 % of the strains harboured the genes for HBL and 99 % for Nhe. The production of all HBL and Nhe components was analyzed using specific antibodies and, in culture supernatants, detectable levels of HBL and Nhe were found for 100 % of hbl-positive and 96 % of nhe-positive strains. The concentrations of the HBL–L2 and NheB component ranged from 0.02 to 5.6 µg/ml and from 0.03 to 14.2 µg/ml, respectively. Comparison of the amount of NheB and HBL-L2 produced by food poisoning and food/environmental strains revealed that the median values for all food poisoning strains were higher than for the food/environmental isolates. The data presented in this work provide evidence that specific and quantitative determination of the enterotoxins is necessary to evaluate the enterotoxic potential of B. cereus. In particular, the level of Nhe seems to explain most of the cytotoxic activity of B. cereus isolates and may indicate an higher diarrheic potential than anticipated.

Abstract

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Produktion von Antikörpern gegen die drei Einzelkomponenten des Non-hemolytic-enterotoxins (Nhe) von Bacillus cereus und deren Einsatz zur qualitativen und quantitativen Analyse der Enterotoxinprofile von 100 B. cereus Stämmen. Es wurde ein kompletter Satz an hoch-affinen Antikörpern gegen jede Einzelkomponente von Nhe (NheA, NheB und NheC) produziert und charakterisiert. Mit Hilfe von synthetisch hergestellten Peptiden, die den C-Terminus des NheC repräsentierten, konnte ein spezifisches Kaninchenantiserum zum Nachweis dieser Toxinkomponente hergestellt werden. Unter Verwendung von gereinigten B. cereus Exoproteinen als Immunogen, konnte ein monoklonaler Antikörper (mAk) gegen NheA und mehrere mAk gegen NheB gewonnen werden. Es wurden keine Kreuzreaktionen mit anderen Proteinen verschiedenster B. cereus Stämme beobachtet. Alle Antikörper gegen NheB zeigten im Zellkulturtest neutralisierende Eigenschaften (bis zu 98 %). Zur Evaluierung der Expression von HBL und Nhe wurden 100 B. cereus Stämme untersucht. Mit molekularbiologischen Methoden konnte festgestellt werden, dass 42 % der Stämme Gene für HBL und 99 % für Nhe besitzen. Spuren der Einzelkomponenten von HBL und Nhe konnten mit Hilfe der spezifischen Antikörper bei 100 % für hbl-positiven und 96 % der nhe-positiven Isolate nachgewiesen werden. Eine Quantifizierung der Expression aller Stämme ergab für HBL-L2 Mengen von 0,02 bis 5,6 µg/ml bzw. für NheB 0,03 bis 14,2 µg/ml. Wenn man nun die detektierten Toxinmengen mit der Herkunft der Stämme vergleicht, kann man feststellen, dass die Medianwerte der in Verbindung mit Lebensmittelvergiftungen isolierten B. cereus Stämmen bei NheB und HBL-L2 höher lagen als bei Umwelt- und Lebensmittelisolaten. Mit dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine Quantifizierung der Enterotoxin-Komplexe zur Einschätzung des enterotoxischen Potentials eines B. cereus Isolates zwingend notwendig ist. Des Weiteren weisen die Daten dieser Studie darauf hin, dass Nhe möglicherweise eine weit bedeutendere Rolle im Krankheitsgeschehen der Diarrhö-Form spielt als bisher angenommen.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: Bacillus cereus, Enterotoxine, Quantifizierung, Bedeutung
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 590 Tiere (Zoologie)
• Fakultäten: Tierärztliche Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 28. Juli 2006
• 1. Bericht­erstatter:in: Märtlbauer, Erwin