Struktur-Funktionsbeziehungen der FhlA- und HydH/G-Regulationssysteme in Escherichia coli

Leonhartsberger, Susanne (2001): Struktur-Funktionsbeziehungen der FhlA- und HydH/G-Regulationssysteme in Escherichia coli. Dissertation, LMU München: Fakultät für Biologie

Abstract

Das σ54-abhängige Regulatorprotein FhlA aktiviert die Transkription der für die Bildung eines funktionellen Formiat-Hydrogen-Lyase-Komplexes nötigen Gene. Hierfür weist es eine Reihe von Aktivitäten auf, nämlich ATP-Hydrolyse, Interaktion mit Eσ54 und Stimulierung der Transkription. Die Aktivität von FhlA wird durch Bindung von Formiat und von spezifischen DNA-Sequenzen (UAS) stimuliert und durch HycA negativ beeinflußt. Sequenzähnlichkeiten von FhlA zu anderen Transkriptionsaktivatoren lassen auf einen Aufbau aus drei Domänen schließen. Die in der vorliegenden Arbeit erfolgte Struktur- Funktions-Analyse lieferte wichtige Ergebnisse über die Domänenstruktur und den Wirkungsmechanismus von FhlA. In vivo- und in vitro-Analysen der C-terminalen Hälfte von FhlA (FhlA-C, Aminosäuren 379 bis 693 von FhlA), welche die Domänen B, C und D von FhlA umfaßt, zeigten, daß dieser Teil von FhlA sämtliche für die Transkriptionsaktivierung und ATP-Hydrolyse benötigten Bereiche enthält. Beide Aktivitäten von FhlA-C sind konstitutiv, bedürfen also nicht mehr der Aktivierung durch Formiat-Bindung. Durch die Bindung von DNA konnte die Aktivität von FhlA-C jedoch gesteigert werden, wobei bei spezifischer DNA ein stärkerer Effekt als bei unspezifischer zu beobachten war. Aus den Ergebnissen wurde ein Modell abgeleitet, in welchem die N-terminale Domäne von FhlA im nicht-induzierten Zustand einen hemmenden Einfluß auf die Aktivität des restlichen Proteins hat. Formiat-Bindung an die N-terminale Domäne hebt diese Hemmung auf und bewirkt eine Steigerung der Aktivität von FhlA durch Erhöhung der Affinität für ATP. Auch die HycA-Suszeptibilität konnte der N-terminalen Domäne zugeordnet werden. Darüberhinaus besitzt die N-terminale Domäne eine strukturelle Funktion, da sie für die Oligomerisierung von FhlA verantwortlich ist. Es konnte gezeigt werden, daß die Bindung von ATP an FhlA eine Änderung der Konformation oder des Oligomerisierungszustandes des Proteins zur Folge hat. Eine Studie zur Verbreitung des FhlA-Regulationssystems ergab, daß in mehreren Spezies der Familie Enterobacteriaceae sowohl ein zu FhlA orthologes Protein als auch Homologe zu hyc- oder hyp-Genen existieren. Die Sequenz von fhlA aus S. typhimurium, E. aerogenes und K. oxytoca wurde bestimmt. Sie zeigt über die gesamte Länge große Ähnlichkeit zu FhlA von E. coli, wobei der Grad der Identität der Gene und Proteine den phylogenetischen Verwandtschaftsverhältnissen entspricht. Die FhlA-Orthologe aus E. aerogenes und K. oxytoca können FhlA aus E. coli funktionell ersetzen und zeigen auch in ihrer Aktivität hinsichtlich der Stimulierbarkeit durch Formiat und Anaerobiose große Übereinstimmung. Desweiteren beeinflußt auch HycA von E. coli die Aktivität der orthologen Proteine, was wiederum die nahe Verwandtschaft der Regulationssysteme zeigt. Im Hauptteil dieser Arbeit konnte der Beweis erbracht werden, daß das HydH/G-Zwei- Komponenten-System die Expression von zraP aktiviert, einem stromaufwärts von hydH gelegenen, in divergierender Richtung orientierten Gen. Für gereinigtes HydG wurde durch Gelretardationsexperimente und DNase I Footprinting-Analyse eine Bindestelle identifiziert, die im intergenen Bereich zwischen hydHG und zraP liegt. Diese 55 bp lange Region umfaßt zwei jeweils 17 bp lange Bereiche mit der Sequenz GAGTAAAAATGACTCGC, die als inverted repeat angeordnet sind. Diese Bindestelle wirkt als UAS in beide Richtungen. Als auslösender Stimulus für die Expressionsaktivierung von zraP durch HydH/G konnte eine Zn2+-Konzentration im Medium von mehr als 0,5 mM identifiziert werden. Pb2+ war zu einem gewissen Grad in der Lage, Zn2+ in der Funktion als Induktor zu ersetzen, jedoch erfolgte keine Aktivierung durch Ni2+, Co2+, Mn2+, Fe2+, Mg2+, Cu2+, Cd2+ oder Hg2+. Gleichzeitig ist HydH/G einer positiven Autoregulation unterworfen, die durch die gleichen Metalle induziert wird. Sowohl für die durch HydH/G induzierte Expression von zraP als auch von hydHG konnte eine Abhängigkeit von σ54 gezeigt werden. Der Einfluß von HydH/G auf die Regulation der Gene für die Hydrogenase 3 tritt entgegen früherer Postulate nur bei Überproduktion des Regulators auf und ist auf "cross-talk" zurückzuführen. Zweidimensionale Gelelektrophorese erbrachte Hinweise auf weitere durch HydG in ihrer zellulären Konzentration beeinflußte Proteine. Obwohl zraP im Zusammenhang mit Zink- Toleranz identifiziert worden war, zeigten die Ergebnisse keinen Einfluß von HydH/G oder ZraP auf die Zink-Toleranz der Zellen.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
• Fakultäten: Fakultät für Biologie
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 28. März 2001
• 1. Bericht­erstatter:in: Böck, August