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Wirkung der Yersinia-translozierten Effektorproteine YopT und YopO auf GTPasen der Rho-Familie
Wirkung der Yersinia-translozierten Effektorproteine YopT und YopO auf GTPasen der Rho-Familie
In dieser Arbeit sollte mittels eines in vitro-Systems die Wirkung des Yersinia-Effektorproteins YopT, einer Cysteinprotease, auf zelluläre Signalwege untersucht werden. Hierzu wurde rekombinant exprimiertes YopT, welches dieselbe biologische Aktivität aufwies wie Yersinia-transloziertes YopT, über die Coexpression mit seinem spezifischen Chaperon SycT in löslicher Form gereinigt. Mittels Interaktionsstudien wurde die Wirkung von YopT auf die RhoGTPasen RhoA, Rac1 und Cdc42 analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass RhoGTPasen, die im Komplex mit ihren zytosolischen Inhibitor RhoGDI vorliegen, als Target für YopT dienen. Dabei wird RhoA von YopT gebunden, proteolytisch modifiziert und anschließend entlassen. Als Folge der Modifikation wird der Komplex zwischen RhoA und RhoGDI getrennt. Rac1 und Cdc42 interagieren ebenfalls mit YopT. Es konnte jedoch keine Modifikation beider GTPasen durch YopT dargestellt werden. Stattdessen binden Cdc42 und Rac1 nach der Wechselwirkung mit YopT in erhöhtem Maße an RhoGDI. Zusätzlich werden die biochemischen Eigenschaften von RhoGDI durch die Wirkung von YopT verändert. RhoA wird durch den Einfluss der Cysteinprotease YopT inaktiviert und kann nicht mehr mit nachgeschalteten Effektoren interagieren. Rac1 und Cdc42 dagegen binden nach Interaktion mit YopT weiterhin in ihrem aktivierten Zustand an ihre Effektoren. Neben YopT ist ein weiteres Yersinia-Effektorprotein bekannt, das mit den RhoGTPasen RhoA und Rac1 interagiert: die Serin/Threonin-Kinase YopO. Hier konnte die Bindung beider GTPasen an YopO unabhängig von der Anwesenheit des Prenylrestes am CTerminus der GTPasen dargestellt werden. Auch als Komplex mit RhoGDI interagierten Rac1 und RhoA mit der Kinase YopO. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass durch die Translokation von YopO im Gegensatz zur Translokation von YopTC139S die drei GTPasen RhoA, Rac1 und Cdc42 zumindest vorübergehend aktiviert werden. In dieser Arbeit konnte außerdem die Kristallstruktur des Chaperons SycT aufgelöst werden. SycT bildet ein Dimer und weist im allgemeinen Ähnlichkeiten zur Struktur anderer Chaperone des Typ III Sekretions- und Translokationsapparates (TTSS) auf. Jedoch unterscheidet sich der Dimerisierungsbereich von SycT strukturell von dem der anderen TTSS-Chaperone. Außerdem konnte gezeigt werden, dass weniger SycT an das biologisch inaktive YopTC139S bindet, was auf eine Interaktion des Chaperons mit dem katalytischen Zentrum der Cysteinprotease YopT hinweist.
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Lehnert, Beatrix
2005
Deutsch
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Lehnert, Beatrix (2005): Wirkung der Yersinia-translozierten Effektorproteine YopT und YopO auf GTPasen der Rho-Familie. Dissertation, LMU München: Fakultät für Biologie
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Abstract

In dieser Arbeit sollte mittels eines in vitro-Systems die Wirkung des Yersinia-Effektorproteins YopT, einer Cysteinprotease, auf zelluläre Signalwege untersucht werden. Hierzu wurde rekombinant exprimiertes YopT, welches dieselbe biologische Aktivität aufwies wie Yersinia-transloziertes YopT, über die Coexpression mit seinem spezifischen Chaperon SycT in löslicher Form gereinigt. Mittels Interaktionsstudien wurde die Wirkung von YopT auf die RhoGTPasen RhoA, Rac1 und Cdc42 analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass RhoGTPasen, die im Komplex mit ihren zytosolischen Inhibitor RhoGDI vorliegen, als Target für YopT dienen. Dabei wird RhoA von YopT gebunden, proteolytisch modifiziert und anschließend entlassen. Als Folge der Modifikation wird der Komplex zwischen RhoA und RhoGDI getrennt. Rac1 und Cdc42 interagieren ebenfalls mit YopT. Es konnte jedoch keine Modifikation beider GTPasen durch YopT dargestellt werden. Stattdessen binden Cdc42 und Rac1 nach der Wechselwirkung mit YopT in erhöhtem Maße an RhoGDI. Zusätzlich werden die biochemischen Eigenschaften von RhoGDI durch die Wirkung von YopT verändert. RhoA wird durch den Einfluss der Cysteinprotease YopT inaktiviert und kann nicht mehr mit nachgeschalteten Effektoren interagieren. Rac1 und Cdc42 dagegen binden nach Interaktion mit YopT weiterhin in ihrem aktivierten Zustand an ihre Effektoren. Neben YopT ist ein weiteres Yersinia-Effektorprotein bekannt, das mit den RhoGTPasen RhoA und Rac1 interagiert: die Serin/Threonin-Kinase YopO. Hier konnte die Bindung beider GTPasen an YopO unabhängig von der Anwesenheit des Prenylrestes am CTerminus der GTPasen dargestellt werden. Auch als Komplex mit RhoGDI interagierten Rac1 und RhoA mit der Kinase YopO. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass durch die Translokation von YopO im Gegensatz zur Translokation von YopTC139S die drei GTPasen RhoA, Rac1 und Cdc42 zumindest vorübergehend aktiviert werden. In dieser Arbeit konnte außerdem die Kristallstruktur des Chaperons SycT aufgelöst werden. SycT bildet ein Dimer und weist im allgemeinen Ähnlichkeiten zur Struktur anderer Chaperone des Typ III Sekretions- und Translokationsapparates (TTSS) auf. Jedoch unterscheidet sich der Dimerisierungsbereich von SycT strukturell von dem der anderen TTSS-Chaperone. Außerdem konnte gezeigt werden, dass weniger SycT an das biologisch inaktive YopTC139S bindet, was auf eine Interaktion des Chaperons mit dem katalytischen Zentrum der Cysteinprotease YopT hinweist.