Kraftspektroskopische Untersuchung einzelner Zytoskelett-Proteine

Schwaiger, Ingo (2005): Kraftspektroskopische Untersuchung einzelner Zytoskelett-Proteine. Dissertation, LMU München: Fakultät für Physik

Abstract

Die Kraftspektroskopie hat sich als eine moderne Methode zur Untersuchung der Elastizität und Entfaltung einzelner Proteine etabliert. Kraftspektroskopische Experimente zeichnen sich unter anderem dadurch aus, dass die Entfaltungskinetik einzelner Proteine bestimmt werden kann. In dieser Arbeit wurde die Kraftspektroskopie zur Analyse der Elastizität und der Entfaltungskinetik einzelner Zytoskelett-Proteine verwendet. Die untersuchten Moleküle, die Superhelix-Struktur des Myosin Schwanzes und das Aktin-bindende Protein Filamin (ddFLN) repräsentieren dabei zwei wichtige Strukturmotive der Proteinfaltung. Die Messungen wurden mit dem Ziel durchgeführt, ein detailliertes Verständnis hinsichtlich des Zusammenhangs zwischen der Struktur der Proteine und deren mechanischen Eigenschaften zu gewinnen. Der Anwendungsbereich der Methode konnte mit Hilfe eines neu entwickelten Messprotokolls erweitert werden. So wurde in Rückfaltungsexperimenten neben der Entfaltungskinetik auch die Rückfaltungskinetik einzelner Proteine bestimmt. Die kraftspektroskopische Untersuchung des Schwanzes des Muskelmotor-Proteins Myosin II zeigte, dass das Molekül über elastische Dehnungseigenschaften verfügt. Die Superhelix-Struktur des Schwanzes weist ein charakteristisches Kraftdehnungsverhalten auf, das bei Dehnung und Entspannung des Moleküls reversibel ist. Das Kraftdehnungsverhalten der Superhelix konnte erfolgreich durch ein Zwei-Zustands-Modell analytisch beschrieben werden. Das Modell beruht auf der Annahme, dass einzelne Segmente der Helix entweder einen gefalteten oder entfalteten Zustand einnehmen. Ferner liegt dem Modell zugrunde, dass ein thermodynamisches Gleichgewicht beim Übergang zwischen den Zuständen besteht. In den Experimenten mit dem Aktin-bindenden Protein ddFLN wurden die Entfaltungskräfte der Immunoglobulindomänen sowie die mechanische Stabilität der Dimerbindung des inelastischen Moleküls bestimmt. Es zeigte sich, dass die Dimerbindung im Vergleich zu den benachbarten Domänen von ddFLN über eine größere mechanische Stabilität verfügt. Experimente mit verschiedenen Konstrukten des Moleküls zeigten außerdem, dass die Entfaltung einer der ddFLN-Domänen, nämlich Domäne 4 (ddFLN4), über einen stabilen Zwischenzustand erfolgt. Auf Basis der NMR-Struktur und der kraftspektroskopischen Daten verschiedener Mutationen von ddFLN4 wurde eine Analyse der Primärstruktur dieses Zwischenzustandes vorgenommen. Demnach entfalten im ersten Entfaltungsschritt 50 Aminosäuren, währenddessen die restlichen 50 Aminosäuren von ddFLN4 den stabilen Zwischenzustand bilden. Wiederholtes Dehnen und Entspannen von ddFLN ergab, dass es sich bei dem Entfaltungszwischenzustand von ddFLN4 ebenfalls um einen Faltungszwischenzustand handelt. Die Analyse der Rückfaltungsereignisse führte zu dem Ergebnis, dass die Rückfaltung von ddFLN4 nur durch ein kinetisches Drei-Zustands-Modell mit einem obligaten Zwischenzustand beschrieben werden kann. Der Zwischenzustand stellt also einen „on-pathway“ Zwischenzustand dar, der von ddFLN4 zuerst eingenommen wird, bevor die Domäne in ihre native Struktur übergeht. Die quantitative Bestimmung der Faltungskinetik von ddFLN4 erfolgte durch Anpassung des Modells an die Daten. Der Vergleich der Faltungskinetik von ddFLN4 und allen anderen Domänen von ddFLN führte zu dem Ergebnis, dass ddFLN4 mit Zwischenzustand eine ca. 10fach schnellere Faltung aufweist, obwohl alle Domänen eine homologe Struktur besitzen. Domäne ddFLN4 stellt demnach ein Beispiel dar, inwiefern ein Faltungszwischenzustand zu einer substantiellen Beschleunigung der Faltung führen kann.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: Kraftspektroskopie, Zytoskelett-Proteine, Proteinfaltung
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 530 Physik
• Fakultäten: Fakultät für Physik
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 3. August 2005
• 1. Bericht­erstatter:in: Rief, Matthias