Advancing DNA origami-based nanomaterials

Baptist, Anna Verena (2026): Advancing DNA origami-based nanomaterials: from reconfigurable nanopores to silicified crystal structures. Dissertation, LMU München: Fakultät für Physik

Abstract

Since US-American researcher Nadrian Seeman laid the foundations for DNA nanotechnology in 1982 with his groundbreaking idea to use DNA as a building material on the nanoscale, the field has rapidly evolved and attracted growing interest over the past decades. Particularly the development of the DNA origami technique has led to major advancements in this reasearch area. Nowadays, the envisioned applications of nanostructures and nanodevices made from DNA span a wide range from synthetic biology via DNA-computing and information storage to optical metamaterials and nanoelectronics. In the framework of this thesis, in total four research projects will be presented that cover different aspects of DNA nanotechnology and address various challenges associated with potential future applications. To study structures at the nanoscale, a variety of biophysical methods were employed throughout the work in this thesis, ranging from state-of-the-art super-resolution light microscopy and electron microscopy to small-angle X-ray scattering. The first project focuses on the development of a large DNA origami nanopore that can undergo conformational changes in response to the presence of a stimulus. The construction of a DNA (origami) nanodevice that forms a transmembrane channel upon insertion into lipid membranes and whose lumen size can be precisely controlled even within the lipid membrane, represents a major advancement compared to the mostly static artificial nanopores published previously. Challenges regarding the fabrication of a switchable nanopore were overcome by implementing an actuator mechanism into a rhombohedral nanopore design relying on the addition or displacement of trigger DNA strands which ensures a reversible and reliable switching of the nanopore. After their efficient insertion into the lipid bilayers of GUVs, the nanopores could be used to selectively allow for the influx of molecules depending on their size. This novel nanopore type opens up new perspectives for molecular sorting or biosensing applications. In the second project, a novel strategy for the upconcentration and the long-term storage of DNA origami nanostructures is presented. While previously established methods for increasing the concentration are often prone to aggregation, the lyophilization of nanostructures with subsequent resuspension in a low volume provides a gentle alternative that ensures a well-distributed DNA origami sample. The storage of DNA origami nanostructures as a lyophilized powder also facilitates their transport and avoids the clustering of nanostructures with increasing storage time. Due to its applicability to differently shaped and even to silica-coated nanostructures, this approach holds great promise with regard to experimental protocols and techniques that require high concentrations of DNA origami, such as e.g. SAXS measurements or single-molecule analysis via cryo-EM. The third project addresses the further development of silicification strategies for DNA origami monomers and crystals. Due to the inherent instability of DNA origami e.g. in biological media containing DNA-digesting enzymes and/or only very low amounts of MgCl2, silicification has been explored as a method to protect DNA origami from detrimental influences while preserving its shape. After contributing to studies investigating the proceeding of the silicification of DNA origami monomers using in-situ SAXS and exploring the accessibility of single-stranded DNA regions after different types of silicification, the focus of the project presented in this part is laid on endowing silica coatings of nanostructures with additional functionalities, in this case fluorescence and dissolvability. This was achieved by incorporating either a customly synthesized silane carrying a fluorescein molecule or a commercially available silica precursor containing a disulfide bridge during the silicification. The findings from this study suggest great potential of these customization strategies for applications in drug delivery or material science. Finally, the fourth project deals with the incorporation of enzymes into silicified DNA origami crystal structures. Since the early days of DNA nanotechnology, there has been a high interest in crystal structures made from DNA due to the possibility for the spatial arrangement of guest molecules in the crystal cavities. Thanks to the stabilizing silica coating, the DNA origami crystals employed in this study can also host enzymes that exhibit optimal activity at conditions that would lead to the disassembly of bare DNA origami superstructures (temperatures above 55°C, low salt conditions, etc.). Such a hybrid crystal system can be of great interest for the formation of catalytic crystals and for exploring the behaviour/the activity of enzymes after their spatial arrangement with defined inter-enzyme distances. The study provides important strategies and findings with regard to the optimization of crystal quality and the incoporation of inactive and active proteins; however, certain challenges such as the quantification of protein uptake into the crystals still need to be tackled in future studies. The work in this thesis spans a bow over different areas within the broad field of DNA nanotechnology and contributes to the further development of structures on the nanoscale, paving the way for future applications e.g. in biosensing, biomedicine or beyond.

Abstract

Seit der US-amerikanische Forscher Nadrian Seeman im Jahr 1982 mit seiner bahnbrechenden Idee, DNA als Baumaterial im Nanomaßstab zu verwenden, die Grundlagen der DNA-Nanotechnologie legte, hat sich dieses Forschungsfeld rasant weiterentwickelt und in den vergangenen Jahrzehnten zunehmendes Interesse erfahren. Insbesondere die Entwicklung der DNA-Origami-Technik hat zu bedeutenden Fortschritten in diesem Forschungsgebiet geführt. Heutzutage umfassen die angestrebten Anwendungen von aus DNA gefertigten Nanostrukturen und Nanogeräten ein breites Spektrum – von synthetischer Biologie über DNA-Computing und Informationsspeicherung bis hin zu optischen Metamaterialien und Nanoelektronik. Im Rahmen dieser Dissertation werden insgesamt vier Forschungsprojekte vorgestellt, die unterschiedliche Aspekte der DNA-Nanotechnologie abdecken und verschiedene Herausforderungen im Hinblick auf mögliche zukünftige Anwendungen angehen. Zur Untersuchung von Strukturen im Nanomaßstab kamen verschiedene biophysikalische Methoden zum Einsatz, die von modernster hochauflösender Lichtmikroskopie und Elektronenmikroskopie bis hin zu Kleinwinkel-Röntgenstreuung (SAXS) reichen. Das erste Projekt konzentriert sich auf die Entwicklung einer großen DNA-Origami-Nanopore, die in der Lage ist, als Reaktion auf externe Stimuli verschiedene Konfigurationen anzunehmen. Die Konstruktion eines DNA-(Origami-)Nanogeräts, das beim Einbau in Lipidmembranen einen Transmembran-Kanal bildet und dessen Lumenweite selbst innerhalb der Lipidmembran präzise kontrolliert werden kann, stellt einen bedeutenden Fortschritt gegenüber den bisher publizierten, überwiegend statischen, künstlichen Nanoporen dar. Herausforderungen bei der Herstellung einer schaltbaren Nanopore konnten durch die Implementierung eines Aktor-Mechanismus in ein rhomboedrisches Nanoporendesign überwunden werden. Dieses basiert auf der Zugabe oder Verdrängung spezifischer Trigger-DNA-Stränge, was ein reversibles und zuverlässiges Schalten der Nanopore ermöglicht. Nach ihrer erfolgreichen Insertion in die Lipiddoppelschicht von großen unilamellaren Vesikeln konnten die Nanoporen selektiv den Eintritt von Molekülen abhängig von deren Größe ermöglichen. Dieser neuartige Nanoporentyp eröffnet vielversprechende Perspektiven für Anwendungen im Bereich der molekularen Sortierung oder der Biodetektion/-sensorik. Im zweiten Projekt wird eine neue Strategie zur Aufkonzentrierung und Langzeitlagerung von DNA-Origami-Nanostrukturen vorgestellt. Während zuvor etablierte Methoden zur Konzentrationserhöhung häufig zur Aggregation der Nanostrukturen führen, stellt die Lyophilisierung (Gefriertrocknung) der Nanostrukturen mit anschließendem Resuspendieren in einem geringen Flüssigkeitsvolumen eine schonende Alternative dar, die eine homogene Verteilung der DNA-Origami-Nanostrukturen in der Probe gewährleistet. Die Lagerung von DNA-Origami-Nanostrukturen als lyophilisiertes Pulver erleichtert zudem den Transport und verhindert die Clusterbildung während längerer Lagerzeiten. Aufgrund der Anwendbarkeit dieser Methode auf unterschiedlich geformte und sogar silizifizierte Nanostrukturen bietet dieser Ansatz großes Potenzial für experimentelle Protokolle und Techniken, die hohe DNA-Origami-Konzentrationen erfordern – beispielsweise für SAXS-Messungen oder Einzelmolekülanalysen mittels Kryo-Elektronenmikroskopie. Das dritte Projekt widmet sich der Weiterentwicklung von Silifizierungsstrategien für DNA-Origami-Monomere und-Kristalle. Aufgrund der inhärenten Instabilität von DNA-Origami, etwa in biologischen Medien, die DNA-abbauende Enzyme enthalten oder nur sehr geringe MgCl2-Konzentrationen aufweisen, wird die Silifizierung als Methode untersucht, um DNA Origami-Strukturen vor schädlichen Einflüssen zu schützen, ohne ihre Form zu beeinträchtigen. Nach Beiträgen zu Studien, die den Verlauf der Silifizierung von DNA-Origami-Monomeren mittels in situ SAXS erforschten und die Zugänglichkeit einzelsträngiger DNA-Regionen nach verschiedenen Silifizierungen untersuchten, liegt der Fokus des in diesem Teil vorgestellten Projekts auf der zusätzlichen Funktionalisierung von Silica-Beschichtungen - hier Fluoreszenz und Wiederauflösbarkeit. Dies wurde durch die Einbindung eines eigens synthetisierten Silans mit Fluorescein-Molekül oder eines kommerziell erhältlichen Silica-Präkursors mit Disulfidbrücke während des Silifizierungsprozesses erreicht. Die Ergebnisse dieser Studie weisen auf ein hohes Potenzial dieser Funktionalisierungsstrategien für Anwendungen in der Biomedizin (gezielte Wirkstofffreisetzung bei der Medikamentengabe) oder in der Materialwissenschaft hin. Das vierte Projekt schließlich befasst sich mit der Inkorporation von Enzymen in silifizierte DNA-Origami-Kristallstrukturen. Seit den Anfängen der DNA-Nanotechnologie besteht großes Interesse an DNA-basierten Kristallstrukturen, da sie eine räumlich definierte Anordnung von Gastmolekülen in den Kristallhohlräumen ermöglichen. Dank der stabilisierenden Silica-Beschichtung können die in dieser Studie verwendeten DNA-Origami-Kristalle auch Enzyme aufnehmen, die ihre optimale Aktivität unter Bedingungen aufweisen, welche zur Dissoziation nicht-beschichteter DNA-Origami-Kristallstrukturen führen würden (z. B. Temperaturen über 55°C, sehr niedrige Salzkonzentrationen etc.). Ein derartiges hybrides Kristallsystem ist von großem Interesse für die Bildung katalytisch aktiver Kristalle und zur Untersuchung des Verhaltens bzw. der Aktivität von Enzymen nach deren räumlicher Anordnung in den Kristallen mit definierten Abständen zwischen den Enzymen. Die Studie liefert wesentliche Strategien und Erkenntnisse zur Optimierung der Kristallqualität und zur Inkorporation inaktiver sowie aktiver Proteine; bestimmte Herausforderungen – wie etwa die exakte Quantifizierung der Proteinintegration in die Kristalle – bleiben allerdings Gegenstand zukünftiger Untersuchungen. Die in dieser Dissertation vorgestellten Arbeiten spannen einen thematischen Bogen über verschiedene Teilbereiche der DNA-Nanotechnologie und leisten einen Beitrag zur Weiterentwicklung von Strukturen im Nanomaßstab, wodurch neue Wege für zukünftige Anwendungen – beispielsweise in der Biosensorik, in der Biomedizin oder darüber hinaus eröffnet werden.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: DNA origami, silicification, nanopore, lyophilization, crystal structures
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 530 Physik
• Fakultäten: Fakultät für Physik
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 6. Februar 2026
• 1. Bericht­erstatter:in: Nickel, Bert