Advancing therapeutic gene editing strategies for inherited retinal diseases: from in vitro development to preclinical evaluation in a USH1C pig model

Casalta, Lucie (2025): Advancing therapeutic gene editing strategies for inherited retinal diseases: from in vitro development to preclinical evaluation in a USH1C pig model. Dissertation, LMU München: Tierärztliche Fakultät

Abstract

Inherited retinal diseases (IRDs) affect approximately 1 in 2000 individuals worldwide, causing progressive loss of vision with limited treatment options. While gene supplementation approaches have shown promise, they face significant limitations including packaging constraints and inability to address certain mutation types. Gene editing (GE) technologies offer a revolutionary alternative by enabling precise modification of the genome itself, potentially providing more comprehensive and durable solutions for patients. This thesis investigates innovative GE strategies for treating IRDs, using Usher Syndrome Type 1C (USH1C) as a model disease with a specific focus on correcting the c.91C>T mutation in the USH1C gene. The work progresses systematically from in vitro testing to preclinical studies in a porcine model. In vitro development of GE strategies in porcine kidney cells (PKC) from USH1C pigs revealed that Twin Prime Editing (TwinPE) achieved the highest efficiency (25-32%) compared to other approaches such as Double Strand Break-Homology Directed Repair (16.3% HDR, 41.4% NHEJ) and Adenine Base Editing (14.5% but with bystander mutations). Novel delivery methods were evaluated, including Virus-Like Particles (VLPs) and Delivery Vector X (DVX). While VLPs showed excellent transfection capabilities for reporter genes (>99%), they demonstrated limited efficiency (6%) for USH1C gene editing. DVX achieved up to 80% gene modification in PKC but is not yet capable of efficiently deliver and allow editing using the TwinPE approach. The management of the USH1C pig model was refined through improved postnatal management protocols. Extensive phenotypic assessments conducted with international collaborators confirmed the USH1C phenotype through electroretinography (ERG) and auditory tests, with ERG revealing increased light sensitivity in USH1C pigs. Preclinical assessment of GE therapy involved subretinal injection of TwinPE via adenovirus (AdV5) into USH1C pig eyes. Analysis demonstrated successful transduction of retinal cells (RPE, PRC, GCL) but limited editing efficiency (0.2%) in RPE. Retinal atrophy was observed at injection sites, indicating the need for improved delivery methods and dosage optimization. Alternative test systems were developed to bridge the gap between in vitro and in vivo studies. Cell cycle manipulation in PKC attempted to mimic post-mitotic conditions through various methods. Retina explants were established as a promising intermediate platform that maintains retinal structure while allowing controlled experimentation. This research advances GE approaches for inherited retinal diseases and establishes important methodological frameworks for translation to clinical applications. Future work will focus on optimizing retinal explant systems, developing photoreceptor-targeted delivery vectors, enhancing GE efficiency in post-mitotic cells, and refining preclinical studies with improved delivery methods and functional assessment.

Abstract

Erbliche Netzhauterkrankungen (Inherited Retinal Diseases, IRDs) betreffen etwa 1 von 2000 Menschen weltweit und führen zu fortschreitendem Sehverlust mit begrenzten Behandlungsmöglichkeiten. Während Genergänzungsansätze vielversprechende Ergebnisse gezeigt haben, stoßen sie auf erhebliche Einschränkungen, darunter Verpackungsbeschränkungen und die Unfähigkeit, bestimmte Mutationstypen zu behandeln. Genome Editing (GE)-Technologien bieten eine revolutionäre Alternative, indem sie eine präzise Modifikation des Genoms selbst ermöglichen und potenziell umfassendere und nachhaltigere Lösungen für Patienten bieten. Diese Dissertation untersucht innovative GE-Strategien zur Behandlung von IRDs und verwendet das Usher-Syndrom Typ 1C (USH1C) als Modellerkrankung mit speziellem Fokus auf die Korrektur der c.91C>T-Mutation im USH1C-Gen. Die Arbeit schreitet systematisch von In-vitro-Tests zu präklinischen Studien in einem Schweinemodell voran. Die In-vitro-Entwicklung von GE-Strategien in Schweinenierenzellen (PKC) von USH1C-Schweinen zeigte, dass Twin Prime Editing (TwinPE) die höchste Effizienz (25-32%) im Vergleich zu anderen Ansätzen wie Double Strand Break-Homology Directed Repair (16,3% HDR, 41,4% NHEJ) und Adenine Base Editing (14,5%, aber mit unbeabsichtigten Begleitmutationen) erreichte. Neuartige Übertragungsmethoden wurden evaluiert, darunter Virus-Like Particles (VLPs) und Delivery Vector X (DVX). Während VLPs hervorragende Transfektionsfähigkeiten für Reportergene (>99%) zeigten, wiesen sie eine begrenzte Effizienz (6%) für USH1C-Genbearbeitung auf. DVX erreichte bis zu 80% Genmodifikation in PKC, ist jedoch noch nicht in der Lage, den TwinPE-Ansatz effizient zu übertragen und die Bearbeitung zu ermöglichen. Die Betreuung des USH1C-Schweinemodells wurde durch verbesserte postnatale Managementprotokolle verfeinert. Umfangreiche phänotypische Beurteilungen, die in Zusammenarbeit mit internationalen Kollaborateuren durchgeführt wurden, bestätigten den USH1C-Phänotyp durch Elektroretinographie (ERG) und Hörtests, wobei ERG eine erhöhte Lichtempfindlichkeit bei USH1C-Schweinen zeigte. Die präklinische Bewertung der GE-Therapie umfasste die subretinale Injektion von TwinPE mittels Adenovirus (AdV5) in USH1C-Schweineaugen. Die Analyse zeigte eine erfolgreiche Transduktion von Netzhautzellen (RPE, PRC, GCL), aber eine begrenzte Bearbeitungseffizienz (0,2%) im RPE. An den Injektionsstellen wurde eine Netzhautatrophie beobachtet, was auf die Notwendigkeit verbesserter Übertragungsmethoden und Dosisoptimierung hinweist. Alternative Testsysteme wurden entwickelt, um die Lücke zwischen in-vitro- und in-vivo-Studien zu überbrücken. Die Zellzyklusmanipulation in PKC versuchte, postmitotische Bedingungen durch verschiedene Methoden nachzuahmen. Netzhautexplantate wurden als vielversprechende Zwischenplattform etabliert, die die Netzhautstruktur erhält und gleichzeitig kontrollierte Experimente ermöglicht. Diese Forschung fördert GE-Ansätze für erbliche Netzhauterkrankungen und etabliert wichtige methodische Rahmenbedingungen für die Translation in klinische Anwendungen. Zukünftige Arbeiten werden sich auf die Optimierung von Netzhautexplantatsystemen, die Entwicklung von Photorezeptor-gezielten Übertragungsvektoren, die Verbesserung der GE-Effizienz in postmitotischen Zellen und die Verfeinerung präklinischer Studien mit verbesserten Übertragungsmethoden und funktionellen Bewertungen konzentrieren.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: Gene Editing, Inherited retinal disease, Usher Syndrome, Adeno-associated-virus, Adenovirus, Pig, Prime editing
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 590 Tiere (Zoologie)
• Fakultäten: Tierärztliche Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 26. Juli 2025
• 1. Bericht­erstatter:in: Wolf, Eckhard